猪细小病毒衣壳残基与转铁蛋白受体结合位点的研究

猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）感染是引起初产母猪繁殖障碍的主要病原之一。受体是病毒宿主嗜性和致病机制的主要决定因素，在猫和犬细小病毒已经证明转铁蛋白受体（TfR）是与感染细胞结合的表面受体，因此也很可能作为PPV感染的细胞表面受体，至少是结合体。本研究在现有的研究基础上，采用基因重组技术，对病毒衣壳蛋白残基进行点突变，将突变体与TfR体外进行结合，通过PPV衣壳残基与转铁蛋白受体的结合位点分析评估，确定TfR是否为PPV感染细胞的特异受体, 揭示PPV与受体结合分子机制，为PPV致病机理研究提供理论基础，也为开发PPV转铁蛋白受体靶向疫苗及与病毒结合的阻断剂等新型药物奠定实验基础。

已有研究证实，与PPV同属的犬细小病毒（CPV）和猫泛白细胞减少症病毒（FPV）的细胞表面受体是TfR，通过病毒的VP2蛋白与其结合，进而感染细胞。尽管PPV与CPV衣壳蛋白氨基酸的组成不尽相同，但其同源性较高，可达50~60%。据此可推测PPV也能够通过VP2与细胞表面的TfR结合，进而感染细胞。.本研究主要将猪TfR和PPV VP2基因进行截短表达，检测截短的猪TfR与VP2是否具有相互作用。截短表达有利于寻找相互作用位点，为后续的受体研究奠定基础。通过在线软件分析，找出猪转铁蛋白受体的胞外区，分成四段，构建原核表达质粒，进行表达并纯化蛋白，将纯化的蛋白免疫小鼠，制备大量多抗血清，为封闭细胞试验奠定基础。将猪细小病毒的VP2基因分成五段，构建原核表达质粒，进行表达并纯化蛋白，将纯化的蛋白免疫小鼠，制备大量多抗血清，为封闭病毒试验奠定基础。.对PPV VP2、TfR和管家基因β-actin的序列设计了特异性的引物，分别建立了SYBR Green 荧光定量PCR检测方法。对PPV感染ST前后PPV的增殖情况及TfR的转录时象进行了对应检测分析，结果表明：PPV在感染ST细胞前后消耗了一定的猪TfR来进行自身的增殖，TfR消耗特征符合作为PPV的细胞表面受体的特征。.通过酵母双杂交技术检测截短的猪转铁蛋白受体与VP2之间是否存在相互作用。将截短的四段猪TfR连接到诱饵载体上，构建诱饵质粒；将截短的五段VP2连接到捕获载体上，构建捕获质粒；分别将诱饵质粒和捕获质粒转化酵母菌株Y2H和Y187。通过携带诱饵质粒的Y2H和携带捕获质粒的Y187之间的双杂交检测截短的猪转铁蛋白受体与VP2之间是否具有相互作用，结果未发现它们之间具有相互作用。.免疫共沉淀是一种研究蛋白之间相互作用的方法，分别构建了VP2和TfR的重组表达质粒，利用激光共聚焦试验证实了VP2蛋白和TfR蛋白可在细胞膜上共定位，进一步用免疫共沉淀试验验证二者是否具有相互作用，结果表明：二者不存在直接相互作用或不具有相互作用。.因此目前我们得到的结论是定量PCR实验说明TfR符合作为PPV的细胞表面受体的特征；而双酵母杂交实验、激光共聚焦试验表明二者不存在直接相互作用或不具有相互作用，后面需要进一步证实。该研究发表SCI 论文4篇，申请专利3项，授权2项，培养研究生3人，完成预定指标。