一氧化氮调控桃果实山梨醇脱氢酶活性的分子机理

山梨醇脱氢酶能催化山梨醇生成果糖，是山梨醇代谢途径的关键酶之一，对改良果实品质具有重要意义。本项目将现代仪器分析方法和分子生物学技术相结合，研究一氧化氮（NO）调控桃果实山梨醇代谢途径中山梨醇脱氢酶活性的机理。（1）利用分子光谱法，研究NO与山梨醇脱氢酶中半胱氨酸残基（Cys44）的化学反应机理，揭示山梨醇脱氢酶S-亚硝基修饰酶的稳定性；（2）利用质谱和磁共振技术鉴定果实中山梨醇脱氢酶S-亚硝基修饰酶的存在与结构，利用试剂盒使Cys44位点突变来研究S-亚硝基化对山梨醇脱氢酶结构和活性的影响；（3）研究外源NO和NO清除剂（PTIO）处理后桃果实山梨醇脱氢酶性质和生理作用的差异；结合转基因技术探讨NO对山梨醇脱氢酶和山梨醇代谢的影响。本项目从化学和分子生物学相结合的角度深入研究NO与山梨醇脱氢酶的关联性和影响果实糖类物质组成的分子机理，为NO调控果实品质提供理论依据。

山梨醇脱氢酶能催化山梨醇生成果糖，是山梨醇代谢途径关键酶之一，对改良果实品质具有重要意义。本项目以肥城桃为试材，将现代仪器分析方法和分子生物学方法相结合，研究一氧化氮（NO）调控桃果实山梨醇代谢途径中山梨醇脱氢酶活性的机制。（1）研究外源NO和NO清除剂（PTIO）处理后桃果实山梨醇脱氢酶性质和生理作用的差异；（2）克隆表达山梨醇脱氢酶重组蛋白，利用表达的重组蛋白进行动力学试验，结合定点突变技术和圆二色分析，研究了NO对SDH空间构象的改变；（3）利用表面等离子共振（SPR）检测亚硝基化蛋白，研究NO与山梨醇脱氢酶中半胱氨酸残基（Cys44）的化学反应机理，解释山梨醇脱氢酶S-亚硝基修饰酶的稳定性，进而提出NO抑制山梨醇脱氢酶活性的分子机理。.研究发现：10 μmol L-1 NO处理显著抑制了桃果实贮藏后期可溶性糖含量的增加和果实糖酸比的变化，有效延缓了果实中糖类物质相互之间的转化，尤其保持了蔗糖相对较高的含量和相对较低的果糖、葡萄糖的含量，显著提高了贮藏期间桃果实山梨醇脱氢酶和山梨醇氧化酶的活性，提高了蔗糖磷酸合成酶的活性，对转化酶（酸性转化酶和中性转化酶）和SS合成方向的活性的抑制作用有时间效应。实时荧光定量PCR试验表明，花后60 d的SDH基因表达量是花后30 d的5.2倍，花后90 d是花后30 d的16.5倍。克隆的目的基因与已报道的序列相似度100%，Escherichia Coli表达的重组蛋白经Ni-NTA柱纯化后具有山梨醇脱氢酶的催化功能。NO对SDH的作用机制呈现非竞争性抑制，利用外源NO对表达的山梨醇脱氢酶重组蛋白进行处理，通过动力学参数表征、荧光吸收、空间构象的圆二色谱以及定点突变后其功能丧失，模拟并提出了NO影响山梨醇脱氢酶活性的分子机理。山梨醇脱氢酶在NO的作用下，其催化域发生改变，导致其催化功能丧失。本项目还研究了NO对桃果实三羧酸循环相关酶活性的影响，并探讨了NO、壳寡糖、花青素处理对采后肥城桃褐腐病的控制机制。.本项目从化学和分子生物学相结合的角度深入研究NO与山梨醇脱氢酶的关联性和影响果实糖类物质组成分子机理，为NO调控果实品质提供理论依据。