以MUC1 VNTR、survivin、FAP-α为靶点的自组装纳米载体基因疫苗研究

Tumor genetic vaccines targeting tumor associated antigens (TAA) have been reported to be rarely effective in controlling tumor growth, which might be due to the presence of immune suppression within the tumor microenvironment or the incapacity of vaccine and immunization in inducing strong immune responses. In the tumor microenvironment, tumor-associated fibroblasts (TAF) which express fibroblast activation protein (FAP) are contribute to the local immunosuppressive microenvironment and render tumor cells more chemoresistant. Therefore, this study intends to construct the DNA and recombinant adenovirus vaccine expressing FAP, MUC1 VNTR and survivin and then investigate the anti-tumor effect of the vaccine in tumor-bearing mice. Meanwhile, in order to enhance the T cell immnune response, immunoadjuvant and optimized immune strategy will be applied in our stratey. To fully play to the advantages of genetic vaccine, self - assemblly nanocomplex with low molecular-weight mannose-bearing chitosan oligomers will be prepare by electrostatic interaction. Nnano-carrier is able to enhance the transfection efficiency of DNA, solve the problems of pre-existing immunity, liver toxicity and rapid clearance by immune system during systemic administration of adenovirus, meanwhile has the function of targeting the antigen presenting cells (APC). Furthermore, the anti-tumor effect will be tested in a mouse tumor model, and the triple anti-tumor mechanism of the vaccine, i.e., inducing high efficient T-cell immunity, eliminating of immune suppression in the tumor microenvironment and increasing intratumoral drug uptake，will also be studied in our project.

肿瘤基因疫苗临床效果不佳的主要原因，可能是肿瘤微环境中存在免疫抑制因素，或疫苗自身的免疫原性差。在肿瘤微环境中，表达成纤维细胞激活蛋白（FAP）的肿瘤相关成纤维细胞（TAF）具有免疫抑制和阻碍化疗药物吸收的功能。因此，本项目拟将FAP与前期研究的肿瘤抗原MUC1和survivin 联用，首次构建三基因融合表达的DNA和重组腺病毒载体疫苗，然后在模型小鼠上考查疫苗的抗肿瘤效果，同时使用佐剂和优化的免疫策略，进一步增强疫苗的T细胞免疫反应。为了充分发挥基因疫苗的优势，进一步构筑接枝甘露糖的壳聚糖寡聚物的自组装纳米载体疫苗，纳米载体可增强DNA的转染效率，解决腺病毒存在的预存免疫、肝毒性和迅速被免疫系统清除等问题，同时具有靶向抗原提呈细胞（APC）的能力。在小鼠模型上考察纳米载体疫苗的抗肿瘤效果；研究疫苗诱导高效T细胞免疫、消除肿瘤微环境中的免疫抑制因素、促进化疗药物吸收相结合的三重抗肿瘤机制。

在肿瘤微环境中，表达成纤维细胞激活蛋白（FAP）的肿瘤相关成纤维细胞具有免疫抑制和阻碍化疗药物吸收的功能。因此将肿瘤抗原（MUC1和survivin）与肿瘤微环境抗原FAP联合制备的疫苗将具有诱导高效T细胞免疫、消除肿瘤微环境中的免疫抑制因素、促进化疗药物吸收相结合的三重抗肿瘤机制。本项目首先构建了MUC1、survivin和FAP三基因融合的DNA疫苗，但融合疫苗并未表现出抗肿瘤效果的增强，甚至还降低了每种抗原的抗肿瘤免疫效应；尽管肿瘤抗原疫苗（MS）和微环境疫苗(FAP)联用可以在预防性实验中起到提高抗肿瘤效果的作用，但是效果并不十分显著。发现在联合组中免疫抑制性配受体CXCR4/CXCL12表达异常，二者的相互作用可促进肿瘤生长、转移。然而，通过加入CXCR4的抑制剂AMD3100并未改善联合疫苗的效果；免疫原性实验结果显示联合后三种抗原的细胞免疫反应均有下降，考虑可能是同时给与抗原太多导致相互干扰。因此，进行了MS和FAP的序贯免疫，即先免疫MS,再免疫FAP结果仍然未能提高抗肿瘤效果。因此，改用survivin与FAP两基因联用的形式，发现二者联用没有影响相互之间的免疫应答水平，但是抗肿瘤效果仍然低于单独疫苗的效果。深入研究发现，可能是FAP作为肿瘤微环境抗原具有一定的特殊性，具体表现为基于FAP的DNA疫苗即具有一定的抗肿瘤免疫效果，但是对其进行各种优化后均不能增强其抗肿瘤活性，比如使用电刺激给药、联合佐剂、构筑纳米载体疫苗、与泛素蛋白标签或可溶性PD-1蛋白融合表达等都未能提高其DNA疫苗的抗肿瘤免疫活性；而且可以通过诱导微环境中IL-10的表达来抑制腺病毒疫苗对DNA疫苗加强免疫的抗肿瘤效果。 然而，通过加入IL-10的抑制剂环磷酰胺有效地降低了IL-10的表达同时释放了腺病毒加强免疫的作用。而且，IL-10的升高很有可能是由FAP抗原引起的，因为在FAP的重组MVA载体疫苗的研究中也发现了在DNA初免-MVA载体疫苗加强免疫后同样出现了IL-10的高表达，并同样可以通过环磷酰胺逆转。基于FAP的特殊性，使FAP与肿瘤抗原联合的疫苗表现不佳 ，具体机制需要继续深入研究。