p75NTR调控Herp介导脑出血后血肿周围域神经元自噬-凋亡机制的研究

Numerous neurons in the vicinity of hematoma undergo dying process following intracerebral hemorrhage (ICH). It is reported that homocysteine-inducible endoplasmic reticulum (ER) stress protein Herp plays an important role in neuronal death after brain injury, probably through the inhibition of autophagy activation. Our previous studies suggest that neurotrophin receptor p75NTR interacts with Herp, and prevents its degradation through ubiquitination. We hereby hypothesize that the expression of both p75NTR and Herp is up-regulated in neurons adjacent to hematoma of ICH, which play a critical role in inducing apoptosis of these neurons. Therefore, manipulation of p75NTR expression would help behavioral recovery following ICH. To test this hypothesis, we will first investigate Herp expression and its association with autophagic formation or neuronal apoptosis in a rat ICH model. Then we will explore the mechanism of Herp in mediating autophagy or neuronal apoptosis in different ER stress models, and its association with p75NTR, and determine the optimal ratio of p75NTR/Herp in inducing the conversion of neuronal autophagy to apoptosis through a gradient interference of p75NTR. Finally, we will manipulate the expression of p75NTR to test the influence of p75NTR/Herp interaction in alleviating the secondary injuries following ICH and promoting behavioral recovery.

脑出血后血肿周围区域有大量神经元处于存活-凋亡临界点。研究发现，内质网应激蛋白Herp在机体内环境紊乱时调节细胞自噬向凋亡的转换，对脑出血后血肿周围域神经元的损伤具有调节作用，但具体的机制不明确。课题组研究发现神经营养因子受体p75NTR能够与Herp作用，通过抑制Herp的泛素化降解介导细胞自噬向凋亡的转换，从而加剧脑出血后血肿周围域神经元的损伤。本课题拟在大鼠脑出血模型中检测Herp的表达变化，分析其与血肿周围域神经元存活、自噬、凋亡的关联；体外诱导不同程度脑出血模型中，检测Herp介导自噬向凋亡的转换与p75NTR的相关性以及调节机制；梯度干扰p75NTR的表达，检测Herp何种表达程度时开始介导神经元自噬-凋亡之间的转换；最后在大鼠脑出血模型中靶向干预p75NTR的表达，探索能否通过干预Herp介导的自噬向凋亡的转换促进脑出血后神经功能的恢复，从而为脑出血的治疗提供新的靶点。

本课题研究中围绕脑出血血肿周围域p75NTR调控Herp介导神经元自噬、凋亡的机制逐步进行。p75NTR作为神经营养因子受体，在介导细胞凋亡过程中发挥重要的作用。Herp作为内质网应激蛋白，在介导细胞存活过程中发挥重要的作用。研究首先通过Co-IP技术验证了p75NTR与Herp在体外的相互作用。通过构建两者的截短质粒，发现两者相互作用的关键区域位于p75NTR的CRD域以及Herp的UBL域。另外，在小鼠脑出血模型中，我们发现ICH后，两者的相互作用增强。在此相互作用的基础上，通过IP技术，我们发现p75NTR可以促进Herp的泛素化降解，从而减少Herp的表达。为了观察Herp对小鼠ICH后神经元凋亡的影响，我们利用血红素刺激原代培养的皮层神经元来模拟ICH模型，结果发现用血红素刺激皮层神经元后，Herp表达水平上调，神经元凋亡减少。利用慢病毒过表达/干扰Herp的表达，结果发现过表达Herp后，神经元自噬相关蛋白LC3B表达上调，凋亡相关蛋白CHOP、caspase9、caspase3等表达下调；干扰Herp后，神经元自噬相关蛋白LC3B表达下调，凋亡相关蛋白CHOP、caspase9、caspase3等表达上调。经过进一步分析p75NTR/Herp在ICH后神经元凋亡/存活中的作用，我们使用慢病毒干扰/过表达p75NTR/Herp，运用Tunel、流式、Western blot等技术检测神经元的凋亡水平，结果表明干扰p75NTR/过表达Herp后，神经元凋亡明显减少。综上所述，本研究首次发现了p75NTR与Herp蛋白相互作用，并且验证了其相互作用具体位点。研究表明Herp通过抑制caspase3的表达从而对神经元起保护作用。p75NTR通过促进Herp的泛素化降解，使Herp表达减少，从而抑制了Herp对神经元的保护作用，介导神经元的凋亡。该研究为深入理解ICH后神经凋亡过程提供了新的线索，对于进一步揭示p75NTR的生物学功能具有重要的科学意义。