神经营养因子受体p75调控OTUB1的磷酸化对脑出血后神经元存活的影响及机制研究

The survival of neurons after intracerebral hemorrhage (ICH) greatly affects the prognosis of hemorrhagic stroke. Studies have shown that neurotrophin receptor p75NTR has the dual functions in ICH, promoting survival and apoptosis of the neurons. While we understand that in the presence of TrkA, after binding to nerve growth factor (NGF), p75NTR promotes neuronal survival in ICH the specific molecular mechanism is still unclear. In the preliminary studies, we found that the intracellular domain (p75ICD) released from p75NTR induced by NGF binding phosphorylates ubiquitin thioesterase OTUB1, which may lead to the inhibition of neuronal apoptosis following ICH. Thus, in the present study, our main goal is to understand the molecular interactions between p75NTR and OTUB1 in ICH. Our specific aims include: 1. exploration of the expression and the interactions of p75NTR and OTUB1 and their association with neuronal survival in ICH animal model; 2. molecular effect of NGF on p75NTR-OTUB1interactions in an in vitro hemorrhage model; and 3. analysis of the molecular mechanism and the effect of p75NTR-OTUB1 interactions on neuronal survival in ICH with molecular intervention in in vitro and in vivo hemorrhage models. Results of our study will help discover new therapeutics in patients with ICH.

脑出血后血肿周围域神经元的存活程度极大地影响着患者的预后。研究显示神经营养因子受体p75（p75NTR）存在促存活和凋亡的双重功能，其在脑出血后介导神经元凋亡的功效已得到证实。然而，在TrkA存在的条件下，p75NTR与神经生长因子NGF结合后还介导神经元的存活，但是具体的机制仍不清楚。课题组揭示NGF诱导p75NTR裂解产生的胞内域p75ICD能够与去泛素化酶OTUB1作用，促进OTUB1的磷酸化，进而发挥促存活作用。因此，p75NTR如何与OTUB1相互作用发挥促存活效应引发我们的思考。本课题拟通过脑出血动物模型，检测p75NTR和OTUB1的表达及相互关系，分析它们作用与神经元存活的关系；通过NGF刺激，检测两者相互作用及产生效应的具体机制；最后通过干预p75NTR和OTUB1的相互作用，综合分析两者相互作用对脑出血后神经元存活的影响及分子机制，从而为脑出血的治疗提供新思路。

脑出血后血肿周围域神经元的存活极大地影响着患者的预后。研究显示神经营养因子受体p75（p75NTR）存在促存活和凋亡的双重功能，其介导脑出血后神经元凋亡的功效已得到证实，但通过何种路径介导这一过程的具体机制仍不清楚。课题组前期工作发现p75NTR、OTUB1在脑出血后均参与神经元存活的调节，且存在相互作用。那么它们存在怎样的调控关系呢？又是通过怎样的途径介导 ICH 后神经元存活的呢？我们在ICH体内外模型中发现脑出血后p75NTR 、OTUB1 表达增强，进一步构建 p75NTR 全长及截断质粒，发现p75NTR-ICD 段与 OTUB1 存在相互作用；通过IP技术，发现p75NTR可以促进OTUB1的泛素化降解。我们在脑出血体外模型中进行了验证，使用慢病毒过表达或者干扰p75NTR 表达，过表达p75NTR后，PI 染色和CCK8提示细胞凋亡增加，WB 提示OTUB1 蛋白表达减少，Bax/bcl-2比值增加，cl-Caspase3表达增加；反之则相反。那么OTUB1又是如何调节下游凋亡信号的呢？我们发现，脑出血后NF-κB经典通路成员 p50、RelA、c-Rel 与非经典途径成员 p52、RelB的核易位均增加，NF-κB经典与非经典信号通路均被激活。通过免疫共沉淀，发现OTUB1与p100、p105存在相互作用，OTUB1可以减少 p100、p105泛素化的降解，泛素化降解的产物p52、p50表达减少，p52/p100、p50/p105比值减少。我们进一步在脑出血体外模型中进行了验证，使用慢病毒过表达或者干扰OUTB1表达，过表达OTUB1后，PI 染色和 CCK8提示细胞凋亡减少，WB 提示p50、p52、RelA、RelB和c-Rel的核易位明显减少，下游的Bax、cl-Caspase3、COX-2的表达明显减少；反之则相反。综上述，本研究首次发现了脑出血后p75NTR与OTUB1相互作用，由p75NTR-ICD 段介导，p75NTR促进了OTUB1的泛素化降解，OTUB1的表达减少，p100、p105泛素化增加，p52、p50表达增加，p50、p52、RelA、RelB和c-Rel核易位增加，NF-κB经典和非经典通路被激活，促进了神经元凋亡和炎症的产生。该研究为进一步揭示p75NTR在ICH后的生物学功能提供了新线索，从而为脑出血的治疗提供新思路。