斜纹夜蛾热激蛋白70调控蜕皮激素受体功能的分子机制

Signal transduction of ecdysone plays a key role in insect metamorphosis. The regulatory mechanisms of ecdysone receptor (EcR) on its down-stream genes have been fully studied. However, the regulatory mechanism of EcR itself remains unknown. The heat shock protein chaperones are a class of important regulators in cell signalling. They are involved in the functional regulation of many steroid receptors. Our earlier studies have revealed that heat shock protein 70 (Hsp70, including its cytoplasmic cognate Hsc70) interacted with both EcR and its heterodimer partner USP, regulated the mRNA expression of its target genes, and affected insect development. However, the detailed mechanism of this complex process has not been disclosed. In this project, an important pest insect Spodoptera litura will be used as our model, and some new techiques including Chip, BiFC, cell transfection, confocal laser scanning and Crispr/Cas9 will be adopted. The research will be focused on the following questions: 1) Influence of Hsp70 on the ligand binding activity of EcR; 2) Effect of Hsp70 on the subcellular localization of EcR; 3) Regulation of Hsp70 on the transcription activation of EcR; 4) Effect of Hsp70 knock-out on development or metamorphosis. This research will reveal the regulatory mechanism of Hsp70 on the function of EcR from the aspect of cellular signal transduction, and this will contribute for fully understanding the mechanim of insect metamorphosis. Moreover, this study will also bring forward some valuable ideas or experiences for exploring the regulatory mechanism of steroid receptors in mammals.

蜕皮激素信号传导在昆虫变态发育过程中起着至关重要的作用。目前关于蜕皮激素受体EcR对其下游基因调控的机理研究得较为深入，但其自身被调控的机制却鲜有报道。热激蛋白是一类十分重要的信号传导调节分子。我们前期的工作表明，热激蛋白Hsp70能同时与EcR和其异源二聚体USP互作，对EcR下游基因的转录产生调节，并对昆虫的生长发育产生影响。然而，Hsp70调控这一复杂过程的详细机制尚未被揭示。本项目拟以我国重要农业害虫斜纹夜蛾为材料，综合运用Chip、BiFC、细胞转染、激光共聚焦和Crispr/Cas9等技术开展以下研究：1）Hsp70对EcR与配体结合能力的影响；2）Hsp70对EcR亚细胞定位的影响；3）Hsp70对EcR转录激活能力的影响；4）转基因敲除Hsp70对生长发育和变态的影响。本研究对完善昆虫变态发育调控机理具有重要意义，对理解哺乳动物甾醇类核受体的调控机制也具有较强的借鉴价值。

蜕皮激素信号传导在昆虫变态发育过程中起着至关重要的作用。热激蛋白70（Hsp70）是一种应激反应蛋白，参与多种信号传导过程。Hsp70是否或如何调控EcR在细胞内的功能呢？我们以斜纹夜蛾为材料，主要开展了以下几个方面的研究：1.Hsp70对EcR与配体结合能力的影响。在斜纹夜蛾胚胎细胞系中利用RNAi减少Hsp70的表达，发现EcR与20E的结合能力显著降低。2.Hsp70对EcR亚细胞定位的影响。通过蛋白质互作、激光共聚焦定位等发现，Hsp70与EcR形成蛋白复合体，并且通过与tubulin α互作，沿着细胞质中的微管系统从细胞质向细胞核迁移。此外，研究还发现所有能够诱导Hsp70入核的因素（20E，JH，高温）都能诱导EcRB1入核，反之亦然。然而，20E诱导下EcR下游基因Hr3C的表达显著上调，但JH和高温却不能激活Hr3C基因的表达。这意味着，外界“刺激因子”来临时，Hsp70作为应激蛋白“主动”响应了这种环境变化或“刺激”，EcR通过与Hsp70互作“被动”地进入细胞核中。并且，只有20E诱导下才能激活EcR的转录激活能力，其它环境“刺激因子”则不能产生这种转录激活效应。3.Hsp70对EcR转录激活能力的影响。通过免疫沉淀实验发现，Hsp70确实能够增强EcR与DNA元件（E74B）的结合能力，从而促进EcR的转录激活。4.Hsp70对生长发育和变态的影响。在斜纹夜蛾中敲除单个Hsp70基因后，并不能影响生长发育。但注射Hsp/Hsc70抑制剂后，昆虫不能正常蜕皮。并且注射tubullin抑制剂也可以观察到同样的表型。以上结果说明，Hsp70通过影响EcR与配体的结合能力、EcR的细胞核定位以及EcR的转录激活能力等多个方面对EcR的功能进行调控。本研究首次揭示20E诱导下EcR的入核是一个“被动”的过程，是Hsp70作为应激蛋白“主动”响应了细胞中环境条件的改变，从而调控了EcR的入核。研究结果是对蜕皮激素信号传导机理的重要完善和补充，有助于全面阐明昆虫变态发育的分子机理。