斜纹夜蛾变态发育期蜕皮激素受体(EcR/USP)互作蛋白的分离鉴定与功能分析

蜕皮激素与蜕皮激素受体（EcR/USP）结合，调节蜕皮激素诱导的早、晚期基因的表达，从而对昆虫的变态发育产生调控。因此，蜕皮激素受体在昆虫变态发育过程中起着十分重要的核心作用。以往对昆虫变态发育的研究多集中于蜕皮激素受体对下游基因的调控，而对蜕皮激素受体本身是如何被调控的，却始终缺乏系统的研究。鳞翅目昆虫是农业生产中的主要害虫，因此对鳞翅目昆虫蜕皮激素受体调控机理的研究具有重要的现实意义。本项目将以我国重要鳞翅目害虫斜纹夜蛾为研究对象，应用酵母双杂交文库技术，大规模筛选变态发育期表皮和中肠组织中与EcR/USP互作的蛋白质；并结合RNAi干扰，分析这些互作蛋白在影响EcR/USP转录表达、细胞核定位以及DNA结合等方面的作用，从而揭示EcR/USP分子调控的机理。本研究不仅能阐明不同发育时期、不同组织蜕皮激素受体的调控机理，还可能发现控制昆虫变态发育的关键基因，为害虫防治提供新的作用靶标。

昆虫变态发育主要受到蜕皮激素（20E）的调控。EcR作为20E的受体通常与USP形成异源二聚体，共同传导20E信号。蜕皮激素受体本身是如何被调控的，目前尚缺乏系统的研究。在本研究中，我们以一种重要鳞翅目害虫——斜纹夜蛾为研究对象，构建了酵母双杂交文库。通过筛选得到114个互作蛋白，其中与EcRB1，USP1和USP2互作的蛋白分别有28，54和32个，未筛选到与EcRA互作的蛋白。我们从中挑选了7种蛋白，包括Hsp70、Hsc70、DnaJ-5（热激蛋白40），MBF2，polyubiquitin， esr16和NEDD8-like，利用酵母双杂交的方法进一步验证了蛋白间的互作关系。结果表明，除NEDD8-like外，其余6种均为阳性互作蛋白。Far-western 和Pull-down试验进一步表明，Hsp70和Hsc70均分别与EcRA、EcRB1、USP1和USP2互作；Hsp/Hsc70 C-末端的“EEVD”结构域是其与USP互作的关键位点。此外， USP1的“DBD”结构域和EcR的“LBD”结构域负责与Hsp/Hsc70互作。在细胞中干扰Hsc70，对EcR的表达没有影响，但20E下游基因如E74B, E75的表达却受到显著的抑制。这意味着热激蛋白分子伴侣在蜕皮激素受体调控中起重要作用。此外，研究还发现EcRB1和USP1具有相似的表达谱，而EcRA和USP2的转录表达也高度相似，这意味着EcRB1/USP1和EcRA/USP2可能是虫体内两种不同的二聚体组合形式。荧光素酶活性分析表明，除EcRA/USP2组合外，EcRA/USP1, EcRB1/USP1, EcRB1/USP2都具有显著的转录激活活性，并且EcRB1/USP1的转录激活活性最强。在20E存在情况下，USP1可以显著增加EcRB1在细胞核中的聚集，而USP2则可以使得EcRB1从细胞核向细胞质中转移。这意味着EcRB1/USP1是变态发育过程中起主要作用的异源二聚体组成形式。上述结果说明，热激蛋白分子伴侣和USP通过与EcR互作，影响EcR的亚细胞定位，从而对EcR的功能产生调控。该研究对进一步完善蜕皮激素信号传导的机理，揭示昆虫变态发育的分子机制具有重要理论意义。此外，本研究还鉴定出了许多与EcR和USP互作的蛋白，这些蛋白质的功能值得进一步深入研究。