类泛素蛋白CIP73在百脉根结瘤信号通路中调控机制的研究

The formation of nitrogen-fixing nodules between legume plants and rhizobia requires the coordinated development of rhizobial infection and nodule organogenisis, which can be separated genetically. Calcium/calmodulin-dependent protein kinase (CCaMK) is a central regulator for both rhizobial infection and nodule organogenesis, and CYCLOPS is a phosphorylation substrate of CCaMK. CYCLOPS forms an ancient signal transduction complex with CCaMK that is specifically required for infection, but is dispensable for nodule organogensis. Using the constitutively active CCaMK as bait in yeast two-hybrid screening, we identified a novel ubiquitin-like protein named CIP73 which is another phosphorylaton target of CCaMK. The CCaMK autophosphorylation defect mutant (T265I) led to spontaneous nodule development. This mutant can also phosphorylate myelin basic protein in a Ca2+/CaM dependent manner, although the activity was lower as compared to the wild-type. The deletion mutant, CCaMK (1-311) and CCaMK (1-326), which also led to spontaneous nodulation, phosphorylated GS peptide constitutively independent of Ca2+ and CaM. Although both of the T265I and the deletion mutants can activate nodule morphogenesis, only the T265I mutant is fully functional to allow bacterial entry, but not the deletion mutants. Based on these, we would like to test whether different CCaMK mutants were functionally different in the phosphorylation of CYCLOPS or CIP73. Determining the differences in the biochemical mechanisms will help to illustrate the functional significance of phosphorylation of CIP73 and CYCLOPS by CCaMK. On the other hand, studying whether CCaMK, CYCLOPS and CIP73 could form ternary complex and screening new CIP73-interacting proteins will help to understand the biochemical and biological functions of CIP73 in the nodulation signaling pathway.

豆科植物能与根瘤菌形成共生体－根瘤，根瘤的形成是根瘤菌侵染和根瘤器官发生协同作用的结果。遗传学分析表明，根瘤菌侵染和根瘤器官发生可以是两个相对独立的过程，而CCaMK在协调这两个过程中起关键调控作用。CYCLOPS是CCaMK的一个磷酸化底物，CCaMK和CYCLOPS形成复合体是根瘤菌侵染所必需的而独立于根瘤器官发生。申请者以CCaMK的蛋白激酶结构域为诱饵，在百脉根中鉴定到CCaMK的另一个磷酸化底物CIP73。本申请项目拟在此基础上，进一步研究不同组成型激酶活性的CCaMK（缺失自我抑制结构域或自磷酸化位点突变）磷酸化CIP73和CYCLOPS之间的异同，揭示CIP73被CCaMK磷酸化的生物学意义。另外，研究CCaMK、CIP73和CYCLOPS能否形成三元复合体，以及筛选与CIP73相互作用的新蛋白，以揭示CIP73的生化和生物学功能，阐明CIP73在结瘤信号通路中的调控机制。

组成型激活的CCaMK突变能导致植株在不接种根瘤菌的情况下自发结瘤（spontaneous nodulation）。自发结瘤现象为我们理解根瘤共生带来了全新的观念，并为实现非豆科植物的共生结瘤提供了突破口。以组成型激活的CCaMK为诱饵，鉴定到一类新型的ubiquitin超家族蛋白CIP73与CCaMK相互作用。初步的生化和分子生物学实验表明，CIP73 是CCaMK的一个新的磷酸化底物，且钙调素能增强底物磷酸化活性；RNAi降低CIP73的表达则能明显抑制结瘤。本项目在此基础上，进一步深入研究了CIP73的生物学功能及其在结瘤信号通路中的调控机制，其结果如下：. 以CIP73为诱饵，在百脉根AD-cDNA酵母双杂交文库中鉴定到蛋白HIP (HSC/HSP70 Interacting Protein) 与CIP73相互作用。HIP是和分子伴侣HSC/HSP70相互作用的一个蛋白，在动物和植物细胞中广泛存在，并高度保守。进一步的缺失突变分析显示HIP的C-末端STI1/HOP/p60同源序列是与CIP73相互作用所必需的。体外蛋白Pull-down和体内双分子荧光互补（BiFC）实验进一步证实HIP与CIP73之间存在相互作用。尽管CIP73蛋白只定位于细胞核中，HIP蛋白却在细胞质和细胞核中均有分布。BiFC实验结果表明HIP与CIP73相互作用能够在细胞质和细胞核中同时发生。另外，CIP73、HIP和CCaMK能够在细胞核中共定位，并且CIP73与HIP之间的相互作用以及CIP73与CCaMK的相互作用能够在同一细胞的细胞核中同时发生，表明这三个蛋白有可能形成复合体在细胞核中行使功能。基因表达芯片数据分析表明Lj HIP基因在各个组织器官中广泛表达，包括：根、根瘤、茎、叶、叶柄、花、豆荚和种子等。荧光定量RT-PCR实验表明在结瘤的过程中，Lj HIP基因在转录水平上呈下调表达趋势。Lj HIP启动子和GUS报告基因融合表达实验表明，在未接种根瘤菌的转基因毛根中，在根尖、维管束和侧根原基中能检测到GUS表达。接种根瘤菌后，在根瘤原基和发育中的根瘤中能观察到GUS活性，然而，在成熟的根瘤中，GUS活性明显降低。RNA干扰(RNAi)降低Lj HIP的表达能在早期阶段抑制结瘤，但在结瘤后期没有明显影响，表明Lj HIP可能在结瘤早期行使负调控功能。