TLR4信号转导干预调控奶牛乳腺炎症反应的研究

To solve the problem of E. coli infection of bovine mammary producing LPS leading to severe inflammatory response harmful to recovery from disease, the innate immune Toll-Like Receptors (TLRs) signal transduction pathways will be introduced to this project. We will apply some molecular biology and immunology techniques to study on TLR4 signaling pathway, and select some key pathway downstream signal molecules such as TIR domain as the main objects of this project. Firstly, we will detect of LPS activated TLR4 signaling pathway critical adapter molecules expression and cytokines secretion effect in vitro and in vivo to clarify the immune mechanism of the mammary gland TLR signal transduction anti-E. coli infection. Secondly, we will design and synthesis blocking peptides of TIR domains to test the intervention effects of these blocking peptides on mice dendritic cell TLR4 pathway signal transduction, and determine these important signal molecules of regulation of immune responses and inflammation, and finally evaluate of these blocking peptides anti-inflammatory and treatment effects on the mastitis animal model. These results will provide a theoretical guidance and experimental evidence for treatment of dairy cattle clinical mastitis by immunoregulation methods.

针对大肠杆菌感染导致的奶牛临床乳腺炎治疗过程中，决定疾病转归最重要的因素之一是控制LPS引起的剧烈炎症反应这一问题，本课题拟以天然免疫理论中LPS通过激活TLR4信号转导引起炎症反应为指导，应用分子生物学和现代免疫学技术，选择TLR4信号通路下游包含TIR结构域的接头分子为主要研究对象，首先在体内外研究LPS刺激奶牛乳腺上皮细胞TLR4信号转导通路时，通路下游分支途径接头分子表达情况及细胞因子分泌效应，确定LPS激活后TLR4信号转导通路中的关键节点分子是那些，然后设计合成不同关键节点分子的TIR结构域封闭肽，观察不同封闭肽对小鼠树突细胞TLR4通路信号转导的干预效应，检验不同封闭肽抑制关键节点分子对免疫应答及炎症反应的影响，最后在乳腺炎动物模型上评价封闭肽的抗炎效果及治疗作用，为利用TIR结构域封闭肽干预TLR4信号转导通路的免疫调节手段治疗奶牛临床乳腺提供新的研究思路和实验指。

奶牛乳腺炎是给奶牛养殖业造成巨大经济损失的主要疾病之一。大肠杆菌是引起奶牛临床型乳腺炎的只要致病菌。本课题针对大肠杆菌感染奶牛时LPS导致剧烈的炎症反应不利于康复这一问题，以天然免疫信号转导理论为指导，应用分子生物学和现代免疫学技术，从TLR4信号通路入手，选择通路下游包含TIR结构域重要节点接头分子为主要研究对象，首先通过体外、体内研究检测LPS激活TLR4信号转导通路关键接头分子表达情况及细胞因子分泌效应，以阐明基于TLR信号转导的乳腺抗大肠杆菌感染免疫机制，然后设计合成TIR结构域封闭肽，检测不同封闭肽对小鼠TLR4信号转导通路的干预效应，确定调控免疫应答及炎症反应的关键节点，最后在乳腺炎动物模型上评价封闭肽的抗炎效果和治疗作用。实验结果显示：在小鼠乳腺上皮细胞上，LPS可以诱导TLR4下游NF-κB和MAPKs的激活及细胞因子TNF-α、RANTES和IL-6的分泌；在LPS诱导的小鼠乳腺炎模型中，LPS可以激活乳腺组织中TLR4下游NF-κB和MAPKs的激活。同时，LPS可以诱导乳腺组织中细胞因子TNF-α、RANTES和IL-6的表达，以上结果说明TLR4信号通路在乳腺炎的发病过程中发挥着重要作用。在此基础上，我们通过软件设计合成三条TIR结构域封闭肽，并检测其对TLR4信号通路的抑制效果。结果发现，三条TIR结构域封闭肽都对TLR4信号通路有明显的抑制作用，其中T1的抑制效果最好。最后，我们在LPS诱导的小鼠乳腺炎模型中，验证三种TIR结构域封闭肽对LPS诱导乳腺炎的治疗作用。结果显示，三种封闭肽都能够显著抑制LPS诱导的乳腺损伤，MPO活性，炎性细胞因子分泌。在小鼠乳腺炎模型中，三种封闭肽可以显著抑制LPS诱导的NF-κB和MAPKs的激活。以上结果显示TIR结构域封闭肽可以通过抑制TLR4信号通路来发挥乳腺炎作用。本研究为通过免疫调节手段治疗奶牛临床乳腺炎提供理论指导和实验依据。