清热解毒药抑制奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的作用研究

临床试验证明金黄色葡萄球菌和大肠杆菌是临床上引起奶牛乳腺炎的主要病原菌，本项研究是利用这些病原菌的培养基制作奶牛乳腺上皮细胞炎症反应模型；利用ELISA、RT-PCR等实验方法检测乳腺上皮细胞发生炎症反应时以及清热解毒药及其组方作用炎症反应模型时，培养细胞的形态和增殖变化以及细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10的变化。目的在于研究奶牛乳腺上皮细胞发生炎症反应时细胞增殖变化、细胞形态变化、细胞因子变化，清热解毒药及其组方对炎症反应的免疫调节作用，以及清热解毒药及其组方对病原菌的抑制作用和炎症反应时细胞因子的变化影响。意义在于为临床治疗奶牛乳房炎寻求最佳抑制乳腺上皮细胞炎症反应的方法，减少因抗生素使用造成耐药菌株的产生和抗生素富集的危害，为细胞抗炎性反应和中药防治炎症反应提供理论依据。

金黄色葡萄球菌和大肠杆菌是临床上引起奶牛乳腺炎的主要病原菌，本项目应用采用组织块种植法培养奶牛乳腺上皮细胞，利用胰蛋白酶差时消化法分离、纯化上皮细胞。成功得培养出奶牛乳腺上皮细胞；并利用金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的培养基成功制作奶牛乳腺上皮细胞炎症反应细胞模型和炎症反应动物模型；利用3H－TdR方法测定细胞增殖率， MTT和ELISA实验方法检测乳腺上皮细胞发生炎症反应时培养细胞的增殖变化以及细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10的变化，证明在炎症反应中细胞边缘模糊不清，细胞出现空泡，随着培养时间的延长低浓度的大量大型细胞开始增加炎症反应变化；观察淋巴细胞在炎症反应时的免疫应答反应，小鼠血清IFN-γ、IL-4表达及IFN-γ/IL-4、IFN-γ/IL-10比值均显著升高（P<0.01）；将清热解毒药作用于上皮细胞炎症反应模型，金银花黄酮类物质对细胞有损害作用，而金银花绿原酸类物质及其水提液在体外有很强的抗炎性反应作用；在高浓度菌液中，金银花水提液的抗炎效果比金银花绿原酸类物质抗炎效果好；连翘苷和连翘黄酮类能明显保护大肠杆菌对小鼠的炎性作用，有很好的抑菌效果；新疆维药黑种草籽乙酸乙酯提取物和乙醇提取物均对细胞炎症模型有抗炎作用；五味消毒饮水煎液0.2 g/ml对细胞炎症模型有显著的保护作用，1 g/ml对小鼠大肠杆菌的感染有保护作用，且降低炎症小鼠血清IL-10浓度，对小鼠免疫机能的调节有一定作用；金银花治疗组较模型组IL-10表达显著升高（P<0.05），IFN-γ表达与IFN-γ/IL-4比值有升高趋势，IL-4表达和IFN-γ/IL-10比值有下降趋势；连翘治疗组较模型组IFN-γ和IL-4表达以及IFN-γ/IL-10比值有下降趋势，IL-10表达和IFN-γ/IL-4比值有升高趋势，均无统计学意义（P>0.05）。感染模型小鼠Th1/Th2细胞因子分泌亢进，Th1/Th2平衡有向Th1漂移的特点。金银花（0.01 g/ml）、连翘（0.01 g/ml）煎煮液能有效保护感染模型小鼠，其调节小鼠的免疫功能可能与Th1/Th2平衡相关。实验证明清热解毒药能够抑制细胞和组织发生炎症反应，中药不同的有效成分对抑制炎症反应各有不同，金银花和连翘提取成分黄酮类对细胞危害较大，这可能与提取方法有关，从实验研究证明中药全药的水煎液抗炎和抑菌效果最好。