奶牛乳腺黏膜抗感染免疫机制研究

针对疫苗被认为是防治乳腺炎的首选措施，而已有疫苗只能使乳腺感染严重程度降低、持续时间缩短、自愈率提高，但却不能阻止相同病原对乳腺的再次感染这一国内外棘手的现实难题，本项目以"乳腺黏膜免疫"，特别是"黏膜归巢"作为理论支持，拟通过建立乳腺内皮/上皮细胞血/奶屏障体外培养模型和乳腺炎发病模型作为研究工具，克隆黏膜归巢受体α4β7基因，获取α4β7纯化蛋白和抗体，通过免疫组织（细胞）化学、流式细胞分选、淋巴细胞过继输注等技术，从淋巴细胞再循环细胞归巢角度出发，以比较黏膜归巢受体和系统归巢受体淋巴细胞的粘附迁移规律为切入点，验证表达黏膜归巢受体α4β7的淋巴细胞对乳腺的免疫保护作用，从而揭示乳腺黏膜抗感染免疫机制，为乳腺炎疫苗的研究开发提供新的理论指导和实验依据。

奶牛乳腺炎是一种给奶牛业造成严重经济的疾病，发病率约为20～70%，每年因患乳腺炎而造成的损失约1 200～3 600元/头，因奶牛乳腺抗感染免疫机制还未完全阐明，至今仍缺乏有效的免疫防控措施。.MAdCAM-1与VCAM-1主要表达在内皮细胞等细胞表面，可与整合素受体α4β7结合介导淋巴细胞归巢。本课题对临床型乳腺炎患牛淋巴细胞表面α4β7的表达规律进行研究；研究MAdCAM-1、VCAM-1分别在健康奶牛与临床乳腺炎奶牛中的表达变化；阐明奶牛乳腺黏膜归巢地址素MAdCAM-1、VCAM-1的表达规律，为今后奶牛乳腺感染免疫的研究提供实验依据与指导。.分别合成奶牛整合素α4，β7的cDNA片段，双酶切后成功构建重组表达质粒pET28a-α4和pET28a-β7，转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导表达，纯化复性后免疫大鼠制备多克隆抗体，Western Blot 检测结果显示所获大鼠抗牛α4和β7抗体能够识别变性状态下的淋巴细胞表面α4和β7亚基，表明此抗体具有较好的免疫原性和反应原性。.采集患临床型乳腺炎和健康奶牛的血液及乳汁，以自制大鼠抗牛α4和兔抗牛β7多克隆抗体作为一抗，以荧光标记的抗IgG抗体为二抗，进行流式细胞仪检测，结果显示，患临床型乳腺炎的奶牛血液及乳汁中表达α4和β7双阳细胞的比率显著高于健康组奶牛（P＜0.05）。.根据GenBank中已报道的MAdCAM-1、VCAM-1基因序列，应用荧光定量PCR技术分析MAdCAM-1和VCAM-1基因分别在健康奶牛及临床乳腺炎奶牛乳腺组织内的表达变化。结果表明：MAdCAM-1、VCAM-1基因在转录水平上在临床乳腺炎奶牛乳腺组织中的表达量均高于健康奶牛。.PCR扩增MAdCAM-1基因的片段，表达载体 pGEX-4T-1相连，转化E.coli BL21(DE3)， IPTG诱导后，对表达产物进行SDS-PAGE及Western Blot分析，用纯化的重组蛋白为抗原，免疫制备多克隆抗体。结果表明，重组原核表达载体转化DE3后获得了有效表达，重组蛋白经过Western Blot验证具有反应原性，并成功制备多克隆抗体。.提取健康奶牛及临床乳腺炎奶牛乳腺组织中蛋白，以VCAM-1和MAdCAM-1蛋白多克隆抗体为一抗，经过Western Blot分析，临床乳腺炎奶牛乳腺组织中MAdCAM-1、VCAM-1蛋白表达