T(brachyury)基因点突变致脊柱侧凸的分子机制研究

Scotiosis shows family aggregation. However its genetic patterns are complex and variable. In our study, we found a pedigree including 12 scotiosis patients, which is autosomal dominant inheritance. Linkage analysis located the pathogenic gene to T Brachyury, which is a T-box transcription factor. It is never reported that T Brachyury is related to scotiosis.T brachyury is expressed exlusively in notochord during embryo development, which play important roles in vertebrate and somites formation. Thus T gene mutation might lead to vertebral malformation via affecting regulation of its target genes. Our preliminary results via EMSA and SPR demonstrated that the binding affinity with DNA was significantly increased in T（Q199R） mutant comparing with T wildtype. In this study, we prepare to establish T（Q199R） mouse model by CRISPR/Cas9 gene editing technology, which may mimic human scotiosis disease development process. We want to clarify the mechanism of scotiosis caused by T brachyury mutation via function study.

脊柱侧凸是一种具有家族聚集性倾向的疾病，其遗传模式复杂多样。在我们研究中发现了一个包括12名患者的常染色体显性遗传脊柱侧凸家系，通过连锁分析定位其致病基因为T brachyury基因。T基因编码一种T-box家族转录因子。T基因突变可导致脊柱侧凸之前从未见报道过。但T基因集中于胚胎发育期的脊索中表达，脊索对于脊柱和体节的生成起着重要的引导作用。因此T基因突变很可能是因为对下游靶基因的调控发生变化从而引起脊柱发育异常。凝胶阻滞电泳和表面等离子共振实验均显示该家系中的T（Q199R）突变显著增强了T基因与DNA的结合能力。因此本研究拟采用CRISPR/Cas9技术通过同源重组构建T（Q199R）小鼠模型，模拟人类脊柱侧凸发病过程，通过分子、细胞、模式动物等不同水平的功能研究揭示出T基因突变导致脊柱侧凸的作用机制，深化对家族性脊柱侧凸发病机理的认识。

T基因（T, brachyury）是T-box转录因子家族最早被发现的成员，一直以来被认为是中胚层发育的分子标志，在多种模式生物，例如小鼠、斑马鱼、爪蟾中都进行了深入的功能研究。近年来有报道，它的拷贝数重复与家族性脊索瘤易感性相关。然而它与人类疾病的相关性目前仍没有遗传证据确凿的相关报道。.在本项目的研究中，我们发现一个包含4代人，15名患者的常染色体显性遗传大家系，通过连锁定位和测序验证发现该家系的致病基为T c.595A>G，p Q199R杂合突变。该研究首次指出T基因的点突变可以引起人类脊椎发育异常，具体表现为颈椎C2-C3融合、胸椎侧弯、下腰椎骶化、骶尾椎缺失。通过CRISPR/Cas9基因敲入小鼠进一步证实该表型的确是由家系中患者携带的Q199R突变引起，杂合小鼠仅有轻微的尾部弯折表型，纯合小鼠尾椎缺失，腰骶椎纵向劈裂，多数死于出生前，即使能够存活也会在出生后二十天内死亡。通过对野生型和突变小鼠的表达谱分析，我们发现有66个基因显著上调，77个基因显著下调，其中与脊椎发育相关的Ift140，Tbx6和Msgn1显著上调，Pax1则显著下调。.由于Q199R突变位点在物种之间极为保守，而且位于T蛋白的DNA结合区域和核定位区域，因此我们通过EMSA和SPR研究发现，T Q199R突变导致T蛋白对于DNA的结合能力显著增强，但是融合蛋白亚细胞定位和核质分离Western实验显示该突变并不影响蛋白的核定位。进一步的 luciferase实验表明其对于下游靶基因的转录活性明显降低，结合T蛋白是以二聚体形式发挥作用，我们推测该突变可能是以显性负效应的方式发挥作用。.通过该研究揭示了脊椎发育过程中相关转录因子网络的作用，深化了我们对于T基因功能及其致病分子机理的认识，有助于临床对于相似症状家族性疾病病因的鉴定与诊断。