米曲霉3.042耐盐蛋白酶的分离、鉴定及耐盐分子机制研究

The protein utilization rate and the quality of soy sauce greatly depend on the halotolerance of proteases secreted by Aspergillus oryzae 3.042.Firstly, based on the techniques of modern enzyme separation, proteomics, biological mass spectrometry and bioinformatics, halotolerant protease will be separated and purified from koji and mash during soy sauce production and its detailed bioinformatics will be obtained as well. Secondly, the halotolerant mechanism of Aspergillus oryzae protease will be elucidated on the static and molecular level by use of the primary and higher structure characteristics of the protease and its active centers, characteristics of the protease inactivation when reacting with specific inhibitors in combination with the result of protein structure homology-modeling.Finally, the halotolerant mechanism of Aspergillus oryzae protease will be clarified on the dynamic and molecular level by tridimensional changing laws of the protease and its active centers when reacting with substrate coupled with result of molecular dynamics simulation under different ionic strenth, pH and compatible solutes.Thus, results of this project will enrich and develop the related scientific theories, and provide theoretical foundation for the reconstruction of Aspergillus oryzae with high halotolerant protease and its industrial application during soy sauce production.

米曲霉3.042产蛋白酶的耐盐性是决定酱油原料蛋白质利用率和质量的关键因素。首先，本项目基于现代酶分离、蛋白质组学、生物质谱和生物信息学等技术手段从酱油大曲和发酵醪中分离纯化出米曲霉耐盐蛋白酶并获取其详细生物学信息。其次，结合耐盐蛋白酶及其活性中心一级和高级结构特征、酶活性基团与特征抑制剂结合导致酶失活的特性及蛋白质同源模建结果，在分子水平上从静态的角度阐明米曲霉耐盐蛋白酶的耐盐机制。最后，以耐盐蛋白酶在不同离子强度、pH值及"相容性溶质"的作用下，酶与底物作用过程中酶及其活性中心的动态变化规律并结合计算机辅助分子动力学模拟结果，在分子水平上从动态的角度阐明米曲霉耐盐蛋白酶的耐盐机制。因此，本研究将丰富和推动学科理论发展，并为米曲霉高产耐盐蛋白酶菌株的构建及其在酱油生产中的应用提供理论依据。

酱油是我国调味品和食品工业的重要组成部分，其产量已超过我国调味品总产量的50%。但我国酱油质量和原料利用率较低，严重影响其国内外竞争力。米曲霉3.042产蛋白酶的耐盐性是决定酱油原料利用率和质量的关键因素，但其所产蛋白酶耐盐性较差、且对其分泌耐盐蛋白酶的种类、理化特性和耐盐机制尚不明确。因此，本项目的开展具有重要的应用价值和理论意义。首先，从酱醪和新鲜大曲中分离和鉴定出一种耐盐天冬氨酰氨基肽酶（gi:5994794）和一种非耐盐中性蛋白酶I（对照，gi:6165646）。同时，制备了两种酶并证实所制备的酶为天冬氨酰氨基肽酶和中性蛋白酶I，分子量分别约为57 kDa和69 kDa。其次，理化分析表明：Co2+对该耐盐酶具有一定的激活作用，Fe2+和Zn2+对其具有一定的抑制作用；EDTA、O-phenanthroline和Bestatin对该耐盐酶具有明显的抑制作用，证明该耐盐酶是一种含锌的氨肽酶。该耐盐酶的最优和最稳定pH为7、最优催化和稳定温度为50 °C。该耐盐酶在3 M NaCl浓度下（pH7.0/37 °C）15 d相对酶活明显高于对照（0），保持30%以上，说明耐盐酶具有较好的耐盐性。与对照相比，该耐盐蛋白酶Km和Vmax值受NaCl（从0 M至3 M）的影响较小，说明该耐盐酶与底物的亲和力和反应速度受高浓度NaCl影响较小。同时分子动力学模拟也证实耐盐酶在3 M NaCl下其RSMD和RSMF值均显著低于其对照相应值，说明该耐盐酶在高盐浓度下分子主链和各个氨基酸均具有较高的稳定性，有利于保持该耐盐酶活性。再次，分别以酿酒酵母液泡蛋白酶I（PDB ID:4R8F）和黑曲霉基质金属蛋白酶（PDB ID:4K90）为该耐盐酶和对照的模板对两种酶进行同源模建。结果显示两者空间结构和活性中心氨基酸组成存在较大差异。该耐盐酶活性中心以酸性氨基酸（亲水性氨基酸）为主（His124、Asp126、Asp300、Glu333、Glu334、Asp381、His475），且大部分暴露或半暴露在酶表面；而对照以其他氨基酸为主（His429、Glu430、Tyr431、Thr432、His433），均包埋在分子内部。该耐盐酶表面酸性氨基酸摩尔含量明显高于其内部和对照酸性氨基酸摩尔含量。高盐环境下水化的表面酸性氨基酸可与特定的碱性氨基酸形成网状“盐桥”，保护其免受盐离子的破坏，增