细胞色素P450还原酶在稻纵卷叶螟生长发育及外源化合物代谢中的作用

NADPH-cytochrome P450 reductase (CPR) is the electron supplier of cytochrome P450 monooxygenases (P450s) in living organisms. Without CPR, catalyse reactions mediated by multiple P450s will be terminated, a wide variety of physiological pathways will be blocked. For the important agricultural insect pest Cnaphalocrocis medinalis, if the CPR gene of the insect were knocked down, we speculate that, the activity of various P450s will be inhibited, the growth and development of the insect will be disturbed, P450-mediated xenobiotic (plant secondary metabolites and insecticides) metabolism will also be inhibited. On the basis of the hypothesis, we plan to (1) clone cDNA sequence encoding CPR in C. medinalis, determine its expression pattern in different tissues and developmental stages, and responses to exogenous xenobiotics; (2) heterologously express the recombinant CPR protein, examine its biochemical property and interaction with P450s; (3) investigate whether CPR is related to growth, development, host plant adoption and insecticide susceptibility of C. medinalis, by using RNA interference (RNAi) to achieve targeted gene knockdown. The aim of the present study is to reveal the potential role of C. medinalis CPR in growth, development and xenobiotic metabolism, and elucidate the physiological significance of CPR to multiple metabolic pathways. The findings will provide novel strategy and potential target for sustainable management of C. medinalis.

细胞色素P450还原酶(CPR)是生物体内众多细胞色素P450单加氧酶(P450)的电子供体。缺少CPR，P450就不能单独完成催化反应，从而导致一系列生理过程受阻。对于重大害虫稻纵卷叶螟来说，若能沉默其CPR基因进而抑制各P450的活性，就有可能干扰其生长发育，削弱其对外源化合物（植物次生物质与杀虫剂等）的代谢能力，从而达到可持续治理此虫的目的。项目组拟在这一假说的基础之上，克隆稻纵卷叶螟CPR基因序列，研究其时空表达规律及受到外源化合物诱导后的转录模式；表达CPR蛋白，研究其生化特征；重点考察利用RNAi沉默CPR基因之后，稻纵卷叶螟的生长发育、对寄主植物的适应性以及对杀虫剂的敏感性是否受到影响。通过本项目的研究，期望能初步揭示CPR在稻纵卷叶螟生长发育及外源化合物代谢过程中的作用，明确CPR沉默对稻纵卷叶螟各生理指标的影响，研究结果可为开发稻纵卷叶螟可持续治理技术提供新思路和新靶标。

稻纵卷叶螟（Cnaphalocrocis medinalis）是危害水稻生产的重要害虫。细胞色素P450还原酶（NADPH–cytochrome P450 reductase，CPR）是生物体内P450氧化还原系统的关键酶，在外源化合物的解毒代谢中起重要作用。本项目对稻纵卷叶螟CPR基因（下称CmCPR）开展研究，希望能初步揭示CmCPR在稻纵卷叶螟生长发育及外源化合物代谢过程中的作用，为开发害虫可持续治理技术提供新思路和新靶标。.利用同源克隆结合RACE技术获得了CmCPR的完整cDNA序列。CmCPR含有一个2046 bp的开放阅读框，编码一个由681个氨基酸组成的蛋白质。此蛋白的氨基端有疏水性跨膜区域，二级结构中存在保守的黄素单核苷酸（FMN）、黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH）结合区域。系统进化分析结果表明CmCPR与二化螟（Chilo suppressalis）CPR的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果表明，CmCPR在稻纵卷叶螟各个组织和发育期中均有表达，其中以高龄幼虫阶段和幼虫中肠组织表达量为最高。原核表达了CmCPR蛋白，测得酶活性为10.3±0.2 μmol/min/mg；以cytochrome c为底物的动力学参数为Vmax=16.5±0.4 μmol/min/mg，Km=13.7±1.3 μM；以NADPH为底物的动力学参数为Vmax=16.2±0.4 μmol/min/mg，Km=20.4±1.9 μM。用亚致死剂量的三种杀虫剂（阿维菌素、毒死蜱和氯虫苯甲酰胺）处理稻纵卷叶螟幼虫后，CmCPR与部分P450基因的表达水平均有不同程度的上调，表明CmCPR参与了P450系统所涉及的对杀虫剂解毒代谢。本研究明确了CmCPR的序列信息、表达模式以及所编码蛋白质的生化特征，相关结果为深入探讨CmCPR在稻纵卷叶螟对外源化合物代谢过程中的作用提供了基础数据。此外，为了进一步了解稻纵卷叶螟解毒代谢过程中相关酶类的功能，本研究中增加了稻纵卷叶螟P450单加氧酶、谷胱甘肽转移酶和羧酸酯酶等内容。