骨肉瘤中一个新Fusion蛋白分泌到exosome中的机制、功能及其临床意义

Osteosarcoma, a high malignant tumor, is insensitive to the current radio- and chemo-therapies, and there is no targeting drug available for this cancer so far. Using osteosarcoma cell lines, we have recently performed the mRNA sequencing analyses and identified and validated one of fusion genes, named as PABPC1-PCBD2 that is called the Fusion gene in this proposal, was detectable by qRT-PCR, FISH and IHC in clinical osteosarcoma samples. Our preliminary results showed that this Fusion gene is probably a driver for osteosarcoma, and obviously enhances the cell migration, invasion and metastasis probably through activating the NF-kB pathway, and that this Fusion protein is a secreted protein, which presents in exosome, and promotes migration and invasion of cells co-cultured with this exosome. This proposal plans to investigate the following events: To further confirm that the exosome containing this Fusion protein enhances the cell migration, invasion and metastasis; To identify the molecular mechanisms of this Fusion protein forming exosome; To explore the clinical potential of this Fusion gene/protein in the aspects of treatments and prognosis for the patients with osteosarcoma; Try to generate this Fusion gene and subsequently produce osteosarcoma in mice using the CRISPR-Cas9 technology. We believe that this proposal will provide a novel target for osteosarcoma and a new strategy for the treatments and individual therapies of osteosarcoma.

骨肉瘤恶性程度高、对放化疗不敏感，尚无靶向药物。我们用骨肉瘤细胞系进行了转录组测序、分析，发现并鉴定了一个新的融合基因（PABPC1-PCBD2，本项目称Fusion基因），在临床骨肉瘤标本中可用qRT-PCR、FISH、IHC检测。预实验表明：该Fusion基因可能是骨肉瘤的驱动基因之一，可增强细胞的迁移、侵袭和转移，其作用机制可能是活化NF-kB通路，该Fusion蛋白可分泌到exosome，并促进与其共培养的肿瘤细胞迁移、侵袭。本项目拟：进一步明确含有该Fusion蛋白的exosome可促进细胞的迁移、侵袭和转移作用；鉴定该Fusion蛋白形成exosome的机制；探讨该Fusion蛋白在骨肉瘤中的潜在治疗价值、临床意义；探讨用CRISPR-Cas9技术在小鼠中产生该Fusion基因，观察该小鼠是否发生骨肉瘤。本项目的完成，将为骨肉瘤的综合治疗、个体化疗法提供新靶标和新思路。

骨肉瘤的恶性程度高、无有效药物，90%患者肺转移，急需治疗靶标。我们在骨肉瘤细胞系和肿瘤组织中，发现了几个与RAB22A1-38相关的融合基因，其融合蛋白（Rab22a-NeoFs）可结合SmgGDS607，促进RhoA的活化，从而促进骨肉瘤的肺转移，并合成了特异靶向的穿模多肽，可阻断该融合蛋白的功能。同时，这类RAB22A1-38相关的融合基因在乳腺癌、肺癌的细胞系和/或肿瘤组织中也存在，并促进肿瘤转移，拓展了该治疗靶标的临床意义（Nat Cell Biol, 2020）。这是首次报道 exon-intron 融合基因，该融合蛋白可促进肿瘤转移，为肿瘤转移提供了新靶标。进一步研究表明：该RAB22A-NeoF1融合蛋白，其暴露的第七位赖氨酸残基必须被乙酰化才有功能，该乙酰化受p300/CBP/HADC6/SIRT1调控（Theranostics，2020）。同时，RAB22A-NeoF1融合蛋白可通过结合HSP90从而被包裹至exosome中，促进肺转移前微环境的形成及该融合基因阴性的细胞中RhoA活化，从而促进骨肉瘤细胞的肺转移（Signal Transduct Target Ther, 2020）。这一系列研究有望为骨肉瘤肺转移提供了新的治疗靶标和策略。目前已有两项与上述研究成果相关的中国发明专利进入实质审查阶段 （申请号：CN201811490126.6；CN201810404047.2）。另外，我们发现在骨肉瘤中，CBX4 通过上调Runx2的表达（由GCN5介导）促进骨肉瘤细胞的转移；CBX4蛋白可被蛋白激酶CK1α磷酸化而降解，CK1α激活剂Pyrviniumpamoate （扑蛲灵）可抑制骨肉瘤的肺转移。因此，CK1α/CBX4通路为骨肉瘤治疗提供了新靶标（Nat Commun，2020）。同时，我们团队发现一条由RAB31标记并控制的ESCRT非依赖的exosome通路，该通路在肿瘤细胞间传递 EGFR 靶向耐药性，为克服肿瘤靶向耐药提供新思路，也为更好地理解exosome biogenesis的复杂异质性提供了重要的理论基础。该研究成果以Article形式于2020年9月21号在线发表于Cell Research。外泌体领域国际著名学者David Lyden（美国康奈尔大学）对该工作给予了高度评价，Cell Research在线发表了其亮点评论。