超声微泡介导shRNA局部下调Smad3对机械损伤致大鼠子宫内膜纤维化的保护作用

Endometrial fibrosis is the pathological feature in Intrauterine adhesions (IUA) . We have constructed ShRNA-Smad3 lentiviral vector and transfected into human endometrial fibroblasts. We found that the interference of Smad3 can reverse the ability of TGF-β1 to promote the production of collagen type I and inhibit endometrial fibrosis. This research intends to establish a rat model of intrauterine adhesions useing simple mechanical damage, position and test TGF-β1 and Smad3 in endometrial tissue in rats in the process of fibrosis progression using immunohistochemical method, Realtime-PCR and Western-blot; at the same time， The Smad3 expression in fibroblasts of rat endometrial were restrained using RNAi technology, blocking TGF- beta 1 signaling pathways, Realtime-PCR and Western-blot were used to observe the effect and EEffect of RNAi on the secretion of extracellular matrix in rat endometrial fibroblasts by ELISA；at the same time， down-regulation of local endometrial Smad3 in rats by ultrasound microbubble mediated shRNA-Smad3 , blocking TGF- beta 1 signaling pathway, and investigate its inhibitory effect on endometrial fibrosis of rats, and lay the foundation for the clinical application of gene therapy of intrauterine adhesions.

宫腔粘连（IUA）的形成过程中，子宫内膜纤维化是主要病理生理特征，但发病机理不清。我们前期构建了ShRNA-Smad3慢病毒载体，经转染人子宫内膜成纤维细胞，发现干扰smad3可以逆转TGF-β1促进I型胶原产生的能力，抑制子宫内膜纤维化。本研究拟采用单纯机械损伤建立大鼠宫腔粘连模型，利用免疫组化、Realtime-PCR和Western-blot的方法，分析纤维化进展过程中TGF-β1和Smad3在大鼠子宫内膜组织中的定位和表达；应用RNAi技术抑制大鼠子宫内膜成纤维细胞Smad3表达，以阻断TGF-β1信号通路，观察基因沉默效果，以及对大鼠子宫内膜成纤维细胞分泌细胞外基质的影响；同时通过超声微泡介导shRNA-Smad3局部下调大鼠子宫内膜Smad3，阻断TGF-β1信号通路，探讨其对大鼠子宫内膜纤维化形成的抑制作用，为临床上采用基因治疗宫腔粘连奠定基础。

宫腔粘连（IUA）的形成过程中，子宫内膜纤维化是主要病理生理特征，但发病机理不清。我们基于雌性SD大鼠原代分离的ESCs细胞（大鼠的子宫内膜基质细胞）加入TGFβ1将其诱导为子宫内膜成纤维细胞，即构建子宫内粘连（IUA）大鼠细胞模型，在验证细胞模型构建成功后，通过加入smad3抑制剂（SIS3）处理细胞模型从而逆转或抑制TGFβ1诱导对所带来的纤维化效果，并通过二代高通量测序技术寻找在上述过程中潜在调控TGF-β1／Smad3信号通路的circRNA、miRNA。其中我们发现circPlekha7在IUA细胞模型中具有抗纤维化作用。circPlekha7作为SMAD3抑制剂SIS3的靶点发挥其抗纤维化作用，其可能是通过靶向mirna或调控宿主基因参与IUA中促纤维化或抗纤维化信号通路。另外我们还发现过表达rno-miR-3586-3p和rno-miR-455-5p可通过促进IUA的致病过程，以及过表达rno-miR-204-3p和rno-miR-3578可抑制细胞行为和IUA进展。本研究为进一步了解IUA的调控机制提供了有价值的信息，并为开发新的IUA诊断、治疗和预防方法提供了基础。