两种甾体皂苷-糖苷酶的水解特异性与其酶蛋白质结构关系的研究

The steroidal saponin is a kind of important natural products, and its C-3 suger chain structure takes great significance to its pharmacological activity. Two kinds of specific glycosidase, which can hydrolyses the steroidal saponins with α-1,4-glycose were observed in our previous study, and the law of their selective hydrolysis was elucidated basically. This study intends to established the three-dimensional structures of above glycosidase through the simulation technique of homologpus template protein base on the primary structures, and to determine the key amino acid sequences which influence the structure and activity of the two enzymes according to the conformation of the enzymes combined with the dioscin and the other substrate. This study also intends to clone the two enzymes, mutate the key amino acid, and assay the activity, so that to verify the rationality of protein simulation and explain the relationship between protein structure and selectivity of glycosyl hydrolysis. Not only this study will be helpful to further undersand the spatial selectivity of the two steroidal saponin glycosidase and their relationship with protein structure, but also it was very significant to understand the essence of enzyme catalysis and the structure basis of selectivity.

甾体皂苷是一类重要的活性天然产物，其C-3位的糖链结构对其药理活性具有重要意义。前期发现了2种水解甾体皂苷α-1，2-鼠李糖或α-1，4-糖基的特异糖苷酶，并基本明确了位置选择性水解规律。本课题拟在以上工作基础上，利用已得到的两种酶蛋白的一级结构，通过同源模板蛋白模拟搭建两种糖苷酶的三维结构；嵌合薯蓣皂苷等底物分子，通过结合时的构象，确定影响两种酶底物空间结构及活性的关键氨基酸序列。克隆表达2种糖苷酶，并对关键氨基酸进行定点突变，测定酶活，以验证结构模拟结果的合理性，解释酶蛋白结构与糖基水解选择性间的关系。以上研究，不仅有助于进一步了解2种特异性甾体皂苷糖苷酶的空间位置选择性，及其与蛋白结构的关系，同时对普遍认识酶催化的本质及选择性的结构基础也具有重要意义。

甾体皂苷是一类重要的活性天然产物，其C-3位的糖链结是其发挥生物活性的重要部位。特异性甾体皂苷糖苷酶的选择性水解，及其与蛋白结构的关系的研究，有助于我们对甾体皂苷的糖链修饰及构效关系的研究，同时对普遍认识酶催化的本质及选择性的结构基础也具有重要意义。前期研究发现了2种水解甾体皂苷α-1，2-鼠李糖或α-1，4-糖基的特异糖苷酶。本课题在此工作基础上，完成了两种特异性糖苷酶（甾体皂苷-1, 2-鼠李糖苷酶和甾体皂苷-α-1，4-糖苷酶）的大量分离纯化，分别得到甾体皂苷-1, 2-鼠李糖苷酶203.6 mg和甾体皂苷-α-1，4-糖苷酶318.2 mg；总结并验证了两种特异性糖苷酶对甾体皂苷糖基的选择性水解规律：甾体皂苷-1, 2-鼠李糖苷酶对甾体皂苷C-3位糖链的α-1, 2-鼠李糖具有选择性水解作用，水解呋甾皂苷的作用强于水解螺甾皂苷，如果C-3位糖链中有β-1，3连接的支链葡萄糖基存在，该酶则不能水解这些底物的α-1，2鼠李糖基，甾体皂苷-1, 4-糖苷酶对甾体皂苷C-3位糖链中α-1，4连接的鼠李糖苷键和阿拉伯糖苷键有特异的水解活性，得到的产物均为脱去α-1，4糖基的次生甾体皂苷；对糖链中只有2个或3个糖基的α-1，4糖苷键水解活性高于有4个糖基的α-1，4糖苷键；完成了两种特异性糖苷酶蛋白一级结构的分析，并利用IBM服务器借助InsightⅡ(2000)分子模拟程序包已对甾体皂苷-α-1, 2-糖苷酶和甾体皂苷-α-1, 4-糖苷酶进行了结构模拟；对两种特异性糖苷酶，利用蛋白结晶条件筛选试剂盒，进行了蛋白结晶试验，但未能成功得到蛋白结晶；利用北京大学高性能平台超级计算机系统资源，对甾体皂苷-α-1，2-鼠李糖苷酶和甾体皂苷-α-1，4-糖苷酶进行分子模建和分子对接，得到两种特异性糖苷酶与典型受体薯蓣皂苷的分子对接模型，进一步揭示了两种特异性糖苷酶选择性催化水解的位点。以上研究，不仅进一步揭示了两种特异性甾体皂苷糖苷酶的空间位置选择性，及其与蛋白结构的关系，同时对普遍认识酶催化的本质及选择性的结构基础也具有重要意义。