滇重楼甾体皂苷生物合成相关酶基因的克隆与调控研究

滇重楼是云南白药、宫血宁胶囊、季德胜蛇药片等著名中成药的主要原料之一,为云南省道地药材。滇重楼主要有效成分是甾体皂苷，其结构复杂，加之滇重楼自然生长缓慢，因此利用现代生物技术生产滇重楼甾体皂苷将是新的途径和方法。本研究拟利用RACE技术从滇重楼中克隆出甾体皂苷生物合成途径中两个重要的调控酶基因- - 鲨烯合酶SS基因和环阿屯醇合酶CAS基因，分析SS基因和CAS基因与滇重楼有效成分甾体皂苷含量的相关性，从分子水平上研究滇重楼甾体皂苷生物合成途径的关键步骤；通过转基因方法分别提高SS基因和CAS基因在滇重楼中的表达量，从而提高滇重楼甾体皂苷的含量，获得高表达外源SS基因和CAS基因的甾体皂苷高含量的滇重楼毛状根株系。本研究为人工调控滇重楼甾体皂苷的生物合成提供依据，为次生代谢工程技术在滇重楼上的应用奠定基础。

滇重楼是云南白药、宫血宁胶囊、季德胜蛇药片等著名中成药的主要原料之一，为云南省道地药材。滇重楼主要有效成分是甾体皂苷，其结构复杂，加之滇重楼自然生长缓慢，因此利用现代生物技术生产滇重楼甾体皂苷将是新的途径和方法。. 本研究成功利用RACE技术分别从滇重楼中克隆出甾体皂苷生物合成途径中两个重要的调控酶基因- - 鲨烯合酶SS基因和环阿屯醇合酶CAS基因的cDNA序列全长，对这两个基因进行了生物信息学分析，并将此序列已提交到NCBI网上GenBank中，收录号分别为JZ876789和KC191813。分别构建了SS基因和CAS基因的原核表达载体，实现了两个基因在大肠杆菌中的表达，对这两个基因的功能进行了初步验证。采用Real-time PCR法检测SS基因、CAS基因在滇重楼根茎、茎段、叶片等部位的表达差异情况，SS基因和CAS基因均在根茎中的表达量相对较高，而滇重楼的有效成分也主要集中在根茎部位，初步说明SS基因和CAS基因的表达与滇重楼的有效成分含量呈一定的正相关。成功构建了SS基因、CAS基因以及两个基因双表达的植物表达载体，并建立起滇重楼毛状根诱导技术体系，成功诱导出携带SS基因、携带CAS基因、同时携带SS和CAS的三种毛状根株系。利用高效液相色谱法对这三种转基因毛状根进行了有效成分重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅱ含量的测定，其中同时携带SS和CAS毛状根中重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅱ的含量最高，是自然根中重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅱ含量的6倍，其次为携带SS毛状根，是自然根中重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅱ含量的4倍，携带CAS毛状根中重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅱ的含量是自然根中含量的3倍。证实本项目中选择的两个基因SS和CAS与滇重楼有效成分的含量呈一定的正相关，在毛状根中过量表达这两个基因，均能够在一定程度上提高滇重楼有效成分的含量。另外，本项目组构建了滇重楼根茎的cDNA文库，在分子水平上保存了滇重楼的遗传资源，并随机挑取1056个单克隆进行5′端测序，获得642个非重复序列（UniGenes），通过比对分析最终获得了21个与次级代谢产物相关的基因。. 本研究结果为从分子水平上研究滇重楼有效成分生物合成的关键酶基因和有目的的人工调控滇重楼有效成分的生物合成提供参考依据，为次生代谢工程技术在滇重楼上的应用奠定基础。