乳热奶牛血清中钙稳态调节机制的研究

以低钙血症为病理学基础的乳热（milk fever）是严重危害围产期奶牛健康的一种重要的营养代谢病。围产期奶牛血清中钙稳态调节机制未发挥作用是奶牛乳热发生的关键环节，但其未发挥作用的机制至今不明。比较研究围产期健康和乳热奶牛血清中钙稳态调节系统的蛋白差异表达情况，可为阐明乳热发病机制和早期诊断奠定理论学基础。比较蛋白质组学技术为全面系统地研究奶牛钙稳态调节系统中的差异表达蛋白提供了方法学保障。本项目拟运用比较蛋白质组学方法对乳热病牛、亚临床低钙血症病牛和健康对照组奶牛血清中差异表达蛋白进行分离、鉴定与验证；并应用生物化学、免疫学和分子生物学等技术检测乳热病牛、围产期不同时期不同血钙水平的奶牛血清中乳热差异表达蛋白和钙代谢主要调节因子的变化特征，明确二者之间的关系，阐明乳热差异表达蛋白对机体血钙稳态的调节作用，为探讨奶牛乳热的分子机制和筛选疾病早期诊断标志物奠定理论基础。

本项目运用蛋白组学技术和免疫学技术及生物化学技术，重点研究奶牛乳热和亚临床低血钙症奶牛血浆差异表达蛋白的分离、鉴定和验证以其与血钙稳态调节之间的关系。通过奶牛乳热组和亚临床低血钙症组与对照组之间的2D-DIGE/MALDI-TOF-MS、SELDI-TOF-MS和iTRAQ/2D-LC-MS/MS实验，结合检测三组奶牛血钙、与钙相关的理化指标及差异表达蛋白的变化，获得如下研究新成果：⑴建立了基于2D-DIGE/MALDI- TOF-MS、iTRAQ/2D-LC-MS/MS和SELDI-TOF-MS三大技术的乳热和亚临床低血钙症奶牛血浆蛋白质组学分析方法。⑵ 成功的分离和鉴定了乳热和亚临床低血钙症奶牛血浆差异表达的蛋白39种，其中上调14种，下调19种。⑶ 应用组学技术验证了10种血浆差异表达蛋白，其中乳热组5种，上调的为免疫球蛋白，下调的为白蛋白、淀粉样蛋白、凝血因子、补体成分；亚临床低血钙症组4种，为下调的淀粉样蛋白、补体成分、载脂蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂。⑷ 应用免疫印迹技术确证了组学技术所获得的乳热和亚临床低血钙症奶牛血浆中表达上调的胰岛素样生长因子结合蛋白1前体（IGFB-1P）和表达下调的β-乳球蛋白前体（β-LGP）。⑸ 初步证实了产前高的正日粮阴阳离子差（DCAD）是奶牛围产期低血钙症高发的主要风险因素之一，而负DCAD能有效的预防奶牛围产期低血钙症。正的DCAD可导致奶牛机体处于碱性状态，而碱性状态会减弱钙代谢主要调节因子（PTH）促进骨钙动员，反之依然。⑹奶牛产前饲喂过瘤胃维生素D能有效预防围产期奶牛低钙血症的发生，初步推荐1.5 g/头过瘤胃维生素D预防效果最佳。⑺ 应用免疫印迹证明围产期奶牛血浆IGFB-1P的丰度与血钙浓度呈负关联，β-LGP丰度与血钙浓度呈正关联。以上研究新发现，从生理学和蛋白组学水平揭示了围产期奶牛钙代谢障碍的发生机制，为今后防治疾病提供了新的策略。