miR-148b在奶牛乳腺发育与泌乳调节中的功能及作用机制研究

Some studies reported that miRNA are involved in the regulation of mammary gland development and lactation by regulating their target genes expression. But the reported researches on the exploration and elucidation of molecular mechanism of some key lactation related function miRNAs are still very limited in animal mammary. In our preliminary research, we found that miR-148b expression in high-milk-quality dairy cow mammary tissue were significantly increased compared with low-milk-quality and non-lactating group by small RNA sequencing technology. We also found that the overexpression of miR-148b can significantly promote the proliferation, and increase the secretion of β- casein and triglyceride by transfecting miR-148b mimics in diary cow mammary epithelial cells(DCMEC). According to the results of our previous studies, we intend to use bioinformatics analysis combined with RIP-Seq to detect the potential target genes of miR-148b, and construct the expression profile of target genes of miR-148b in diary cow mammary. Then, we will use the vitro overexpression or inhibition of miR-148b in DCMEC, together with the vivo animal experiments to analysis the function and molecular mechanism of miR-148b in regulating development and lactation of mammary gland. Our project will provide some important theoretical guidance for the optimization of milk yield and quality in dairy industry.

一些研究报道，miRNA能通过调控其靶基因的表达进而参与乳腺发育与泌乳等生物学过程的调节，但目前关于动物乳腺中泌乳关键功能miRNA的发掘及作用机制的研究还非常有限。前期利用small RNA 测序技术发现miR-148b在高泌乳品质奶牛乳腺组织中的表达显著高于低乳品质与干奶期组，并应用miR-148b超表达子转染奶牛乳腺上皮细胞后发现miR-148b超表达能明显促进细胞的增殖及β-酪蛋白、甘油三酯的分泌。针对上述前期研究结果，本项目拟采用生物信息学分析结合RNA免疫共沉淀测序技术（RIP-Seq）检测miR-148b潜在的靶标基因，构建miR-148b靶基因表达谱。然后，采用奶牛乳腺上皮细胞中miR-148b超表达、基因沉寂体外研究结合动物学体内实验验证解析miR-148b在乳腺发育与泌乳调节中的功能及分子作用机制，为目前国内奶业提升牛奶产量及优化乳品质量提供重要理论参考。

miRNA作为一类非编码小分子RNA通过高效调控靶基因参与生物体多项生命活动的调节，miRNA表达的改变与它的生物学功能密切相关，课题组前期研究发现miR-148b在不同时期、不同泌乳品质奶牛乳腺组织中表达差异显著，研究围绕确定miR-148b在奶牛乳腺发育泌乳中的生物学作用、明确miR-148b与各乳腺发育及泌乳相关功能基因之间的调节关系、阐明miR-148b调节奶牛乳腺泌乳的调节路径及作用机制等几个关键的问题进行展开。研究结果表明miR-148b在乳腺泌乳期的表达显著高于非泌乳期，miR-148b超表达能够明显提升奶牛乳腺上皮细胞活力，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，增加奶牛乳腺上皮细胞β-酪蛋白、甘油三酯及乳糖的合成与分泌，在小鼠乳腺组织中表现为腺泡数量增加，乳腺腺泡腔扩大，乳腺组织中脂滴分布增加，小鼠乳腺泌乳量及乳汁中蛋白质、乳糖含量明显提高。课题筛选并确定了奶牛乳腺上皮细胞中miR-148b调节乳腺泌乳的3个关键靶基因Tgfb2、Socs3、Pten及其相互作用结合位点，研究结果表明miR-148b超表达能够通过负调控其靶基因Tgfb2、Socs3、Pten mRNA及蛋白的表达，上调其靶基因下游调控的乳腺发育及泌乳中乳蛋白及乳脂合成、细胞增殖、凋亡相关通路功能基因JAK2、STAT5、PPARγ、MAPK、AKT、mTOR、SREBP1、S6K1、CyclinD1、GLUT1、β-casein、Bcl-2的表达而抑制Bax、Caspase-3、Smad3的表达进而发挥其调节乳腺泌乳的分子生物学作用， 并且在小鼠乳腺体内的动物学验证实验中获得了相符的研究结果。本课题通过奶牛乳腺组织、奶牛乳腺上皮细胞以及小鼠泌乳动物学实验研究，从体外实验、体内实验在细胞水平、组织水平等多个层面上系统而深入的阐明了miR-148b调节乳腺发育与泌乳的作用机制，挖掘了一个新的与乳腺发育与泌乳密切相关的重要功能miRNA（miR-148b），研究进一步完善了关键miRNA 与乳腺发育及泌乳相关功能基因的调节关系，为乳腺生物学在小分子RNA水平的研究提供了新的参考，对国内奶业乳产量的及乳品质量的改善具有一定的理论及生产指导意义。