禽蛋蛋清抗菌功能性蛋白质体系作用特性及其分子机制研究

Egg albumen has unique physical and chemical properties and contains a network of defenses against microbial infection. It was considered to play an important role in antibacterial defence of the egg yolk and the avian embryo. And exploitation and utilization of antimicrobials in egg albumen has always been a hot topic in egg science. However, the antibacterial role of egg albumen and mechanisms of action of the antimicrobial proteins is lack of deep understanding. Thus, in this work we plan to study on egg albumen collected from incubated eggs and eggs stored for different periods. Including the study of :1) The changes of antibacterial system and antibacterial activity of egg albumen during egg storage and egg incubation. 2) The functional properties and mechanisms of action of egg albumen antimicrobial proteins during egg incubation and egg storage. 3) In vitro study of the antimicrobial proteins network of egg albumen. The research method will be an integrated application of fluorescent stain technique, flow cytometry, RT-PCR and some other advanced technologies for molecular and cellular biology. From this research, we would reveal the underline antimicrobial mechanisms of egg albumen proteins so as to provide theoretical basis and technical guidance for and the control of infections in egg production and the exploitation and utilization of antimicrobials in egg albumen.

禽蛋蛋清具有独特的物理特性和丰富的化学因子，形成了复杂的抗菌体系，在贮藏及孵化过程中防止禽蛋受微生物感染，保证卵黄内营养物质免受破坏，保持胚胎活性等方面发挥着重要作用。蛋清抗菌因子的作用特点、作用机制及其开发与应用始终是国内外蛋品科学研究的热点问题，但蛋清抗菌体系的作用特征及机理还缺乏深入的认识。基于此，本研究以贮藏及孵化过程中禽蛋蛋清为研究对象，采用荧光染色技术、流式细胞仪技术，以及RT-PCR等细胞生物学、分子生物学研究技术，主要开展以下三个方面的研究：1) 贮藏及孵化过程中蛋清抗菌防御体系变化及其对禽蛋蛋清抗菌功能的影响；2) 贮藏及孵化过程中蛋清抗菌蛋白质抑菌特性及其作用机制研究；3) 蛋清抗菌蛋白防御体系的体外构建及结构与功能关系研究。通过研究揭示禽蛋蛋清抗菌蛋白体系的抗菌机制，以期为禽蛋抗菌物质的综合利用和禽蛋病原微生物的控制提供理论依据及技术指导。

鸡蛋蛋清具有独特的物理特性和丰富的化学因子，有可能在防止微生物感染、保证卵黄内营养物质免受破坏，保持胚胎活性等方面发挥重要作用。深入挖掘孵化蛋清抗菌特性及其作用机制，旨在揭示蛋清抗菌因子在孵化条件下的作用特点及相互作用关系。具体研究内容和结果如下：.研究测定了孵化早期蛋清基本理化性质及体外抗菌活性的变化。结果表明，蛋清pH值在孵化约48 h后上升至最高值，而蛋白高度下降到最低值；之后，蛋清pH值开始降低，蛋清开始浓缩，浓蛋清及稀蛋清粘度均快速上升。孵化早期蛋清的理化性质的变化直接影响蛋清的体外抗菌功能。.卵转铁蛋白和溶菌酶是蛋清内含量最丰富的两种抗菌功能性蛋白质。随着孵化时间的延长，卵转铁蛋白的浓度不断增加，而溶菌酶的浓度变化很小。表明溶菌酶在禽蛋孵化早期可能存在一定程度上的降解。蛋清溶壁活性开始缓慢增加，这种变化可能与孵化蛋清内动态变化的pH有关。.孵化早期浓蛋清的液化，粘度的下降可能与蛋清内部蛋白质分子间的相互作用或蛋白质的降解有关。孵化早期浓蛋清与稀蛋清pH、溶菌酶、卵转铁蛋白含量无明显差异。浓稀蛋清转铁活性、溶壁活性、抗菌活性的变化趋势一致。.采用细菌活性荧光探针（SYTO9/PI）标记技术结合流式细胞仪技术，体外模拟研究了蛋清抗菌因子卵转铁蛋白、溶菌酶在孵化早期过程中的协同抗菌作用效果。在体外条件下，卵转铁蛋白能够破坏肠炎沙门氏菌的膜结构；溶菌酶抑制肠炎沙门氏菌的作用能力相对较弱。当环境pH增加时，卵转铁蛋白、溶菌酶抗肠炎沙门氏菌的作用活性均增强，孵化早期禽蛋蛋清蛋白质及其作用环境之间存在复杂的抗菌相互作用关系。.通过电化学循环伏安法和双偏振极化干涉的方法定性的对所选取的两组蛋白质进行相互作用验证。循环伏安法中，对电极表面进行修饰。将蛋白质依次固定在电极表面。通过电信号的变化发现卵白蛋白和卵转铁蛋白，卵白蛋白和溶菌酶两组蛋白质之间均存在有相互作用。.使用红外光谱以及圆二色谱的方法对两组蛋白质的二级结构进行判定，实验结果显示，经过48h相互作用之后，蛋白质的二级结构中有序的α螺旋和β折叠有所降低，代表无序结构的无规则卷曲程度有所升高。其中使用红外光谱与圆二色谱所得结果一致。.溶菌酶与卵转铁蛋白为蛋清中重要的抗菌蛋白质，为进一步探究蛋白质相互作用对抗菌性能的影响，在最佳抑菌时间对细菌形态进行测定发现蛋白质的相互作用对细菌的抑制具有协同作用。