鸭蛋清肽/壳寡糖纳米递送钙体系组装及其高效机制研究

Calcium load and stability of delivery system, and intestinal absorption are three key factors affect the calcium bioavailability. The aim of this project is to fabricate three nano-delivery systems based on duck egg white peptides (DPs) and chitosan oligosaccharide (COS). Firstly, DPs and COS is connected based on Amadori link (DPs-COS); secondly, DPs and COS is connected based on the crosslinking agent calcium (DPs-Ca-COS); thirdly, DPs-Ca is embedded in the cage-type molecular formatted by COS. These three delivery systems are expected to increase the calcium load and the stability, and improve the calcium bioavailability together in the progress of calcium release in the intestine. Isothermal Titration Calorimetry (ITC) and Microthermal Surge Meter (MST) are used to evaluate the thermodynamic process in the interaction between three materials. SEM, FI-IR, AFM, fluorescence spectra, NMR is used to clarify the morphology and structure features. Molecular dynamics and quantum chemistry are used to evaluate the binding sites and micro action model. Additionally, several inhibitors of peptide transporter, endocytosis and calcium channels are used to reveal the absorption mechanism by using Fluo-3AM and laser confocal scanning microscope in Caco-2 cells. Moreover, low-calcium diet rat model is used to evaluate the effects and mechanisms of calcium delivery systems in the improvement of calcium bioavailability in vivo.

钙载量、稳定性及肠道吸收功能是影响钙制剂生物利用率的关键因素，本项目以蛋清肽、壳寡糖为材料，构建不同组装模式的蛋清肽/壳寡糖纳米递送体系：Amadori连接构建蛋清肽-壳寡糖纳米体系、Ca交联剂构建蛋清肽-Ca-壳寡糖纳米体系、壳寡糖笼型分子包载蛋清肽-Ca螯合物体系，旨在提高钙载量及稳定性，使钙缓释的同时，活性肽和益生元协同提高其钙的生物利用率。利用等温滴定量热法和微量热泳动仪研究三者之间组装的热力学行为；利用扫描电镜、红外、原子力显微镜、荧光光谱、核磁共振等手段研究纳米体系的形貌及结构特征，利用分子动力学及量子化学手段解析其结合位点和微观作用模式；通过Caco-2单层细胞模型，结合Fluo-3AM荧光探针、激光共聚焦扫描显微镜，并借助小肽转运抑制剂、细胞内吞阻断剂、钙离子通道抑制剂等，揭示其生物利用途径；通过低钙饲料大鼠模型评价纳米递送体系的提高钙生物利用率效果，厘清其协同机制。

本项目以鸭蛋蛋清肽（DPs）、壳寡糖（COS）为材料，采用三种不同组装模式构建了三种鸭蛋蛋清肽-壳寡糖递送钙系统，旨在提高钙载量及调节螯合物的稳定性，使钙缓释的同时，利用活性肽与益生元协同作用，提高其钙的生物利用率。主要研究结果如下：（1）热诱导DPs-COS的可溶性钙结合量相对于DPs提高了248%，此反应由DPs的-NH2与COS乙酰基上的C=O形成。该递送体系在胃环境中能够减缓钙离子的释放，使更多钙离子进入肠环境中，从而促进钙吸收。（2）在TGase-DPs-COS的可溶性钙结合量相对于DPs提高了205%。其糖肽结合位点为DPs链上的氮端端基、侧链氨基和COS上的氨基。在Caco-2单层细胞模型中，该递送体系相比于CaCl2，Ca的转运率提高76%。（3）DPs-Ca/COS-TPP（三聚磷酸钠）笼状分子体系的钙含量达到了21.01 mg/g。DPs-Ca包裹在COS-TPP的网络间隙中，形成了笼状微球。在胃环境中能够减缓钙离子的释放，从而促进钙吸收。（4）基于低钙膳食模型和植酸抑制钙吸收模型，三种递送钙系统的体内促钙吸收效果均较好，且具有调节肠道健康的功效，提示三种钙递送系统具有缓释效果，可能为补钙剂的选取提供新策略。（5）体外发酵实验表明DPs-COS递送系统显著提升有益菌丰度，增加SCFAs的含量。Gallus-gallus模型表明注射DPs-COS共价物后，小鸡小肠内SCFAs含量、有益菌丰度及小肠功能基因表达显著上升，并能逆转植酸带来的负面作用。综上，热诱导DPs-COS、TGase-DPs-COS、DPs-Ca/COS-TPP三种钙递送体系均能提高钙载量，促进钙生物利用率，并维护肠道健康。