沙漠小球藻应答水盐胁迫的基因表达与调节研究

Chlorella is a perfect material for studying gene expression and regulation characteristics of plant, which is under water and salt stress, at the single cell level. At present, the related researches in this area are growing. In this study, through establishing the model of water and salt stress using Chlorella from desert of Xinjiang, we will study and analyze the varied regular patterm of the desert Chlorella's intracellular glucose and protein content, the expression and their regulating characteristics of genes related to intracellular signal's perception and the transmission pathways including the variation of transcriptome expressional level, the content of ABA hormone and LEAs protein and the varied regular patterm of the related transcription factors'(BhHsf1、CpHB-7、BhWRKY1)real-time expression by using the methods of Digital genome expression spectrum's analysis (DGE), quantitative real-time PCR, Northern Blot , Western Blot and protein's two-dimensional electrophoresis. The researches can provide experimental evidence for the molecular mechanisms of stress resistance and the processes of evolution from single cell lower plants to complex higher plants.

沙漠小球藻是在单细胞水平上研究水盐胁迫条件下低等植物基因表达及其调控特征的重要材料之一。这方面的研究日渐增多。本研究利用从新疆沙漠中分离、纯化培养的小球藻，通过建立其水和盐胁迫模型，运用数字基因组表达谱分析（DGE）、实时定量PCR（qPCR）、Northern Blot、Western Blot、蛋白质二维电泳等技术方法，研究和分析比较在水盐胁迫条件下沙漠小球藻胞内糖和蛋白质等组成型成分含量及其变化规律，胞内信号感受与传递途径相关调控基因的诱导型表达及其调控特征，包括藻细胞转录组水平、胞内IAA/ABA含量、LEAs蛋白(Ccor1/Ccor2、Cw80、Lea3)，sHSPs以及相关转录因子（BhHsf1、CpHB-7、BhWRKY1）实时表达变化规律。为单细胞低等植物向复杂高等植物进化过程中，在新疆特定生境下，水盐胁迫应答分子机制及其演进提供实验证据。

本项目以从新疆古尔班通古特沙漠、塔克拉玛干沙漠中分离、纯化培养的小球藻为研究对象，分别以PEG6000、NaCl做为形成水、盐胁迫的主要试剂，筛选出了对水、盐胁迫响应最显著的沙漠小球藻TDL6B。以此为研究材料，筛选出其水胁迫合适的PEG6000浓度范围为0～0.3 g/ml，盐胁迫适合的NaCl浓度范围为0～0.8mol/L；测定并分析比较了其在不同水分、盐分胁迫条件下，胞内可溶性糖、氧化酶、总脂、可溶性蛋白、激素含量等生 理生化指标的变化规律，通过相关性、主成分分析、逐步回归和通径分析等方法，建立了沙漠小球藻抗旱性和耐盐性评价的线性回归模型，从而为蛋白组和转录组分析提供具有不同生长阶段代表性样品奠定理论依据。通过沙漠小球藻水溶性蛋白质的双向电泳分析，对沙漠小球藻正常与水胁迫处理条件下表达差异蛋白进行了对比分析，共鉴定出29个干旱胁迫差异表达蛋白，其中12个事表达上调的蛋白，19个是表达下调的蛋白，功能分类分析表明，这些蛋白主要参与胁迫应激响应、能量生成与转化、光合作用、物质代谢等生物学过程。通过正常（对照组）和水、盐胁迫（实验组）条件下小球藻样品进行转录组分析，统计和分析与抗逆（LEAs蛋白、sHSPs等基因）、油脂积累程度呈正相关且与对照组相比差异显著的基因，对这些基因的结构、功能及与油脂积累的相关性进行分析。并通过qRT-PCR检测12个候选基因在各生长时间段的表达水平，与同一状态下小球藻抗逆指标、油脂积累程度对比分析验证。构建转人乳铁蛋白基因沙漠小球藻1株，发表核心期刊论文6篇，待发表2篇，发表SCI期刊论文1篇，待发表1篇，培养博士1名，硕士6名，到目前为止，已完成本项目任务书所提出的研究内容和研究目标。