柽柳ERF基因应答高盐胁迫的分子调控机理

ERF(ethylene resposive factor)是植物所特有的一类转录因子，参与多个信号途径的调控，与胁迫的耐性密切相关。我们从柽柳中分离了多个ERF基因。在此基础上,进行ERF的转录下游调控机制、转录调控以及上游调控因子3个层次的研究。先将ERF转入拟南芥，筛选出抗逆性最强的ERF进一步研究。用cDNA芯片技术比较转ERF基因和野生型拟南芥的基因表达差异，确定ERF所调控的下游靶基因。对下游靶基因启动子分析，鉴定该ERF可能作用的顺式元件。研究ERF的转录激活能力，与之互作的蛋白以及其活性的调控等。在植物细胞中研究转录因子与顺式元件的相互作用及作用强度。克隆转录因子的启动子序列，鉴定转录因子启动子的顺式作用元件，研究其上游的调控基因及及其调控信号通路。将启动子与GUS融合，转入拟南芥，研究该基因的时空表达。通过以上研究来阐明ERF基因对抗逆性调控的分子机理及其调控网络。

克隆获得了一条柽柳的ERF基因（ThERF）全长cDNA序列，其开放读码框为972 bp，编码由323个氨基酸组成的蛋白质，分子量为34.1 KDa。根据其cDNA序列，利用Tail-PCR技术获得了其启动子序列，长940 bp。经PLACE及Plantcare等预测发现启动子中有多种胁迫响应相关的元件。同时，ThERF基因能够响应盐、旱及ABA等逆境胁迫。ThERF基因能够特异地识别顺式元件GCC-BOX（AGCCGCC）和DRE（TACCGACAT）。ThERF启动子上含有GCC-BOX、WBOX和MBS（MYBcore）等元件，根据这3种元件序列，利用酵母单杂交技术分别得到了与GCC-BOX互作的ERF10基因，与WBOX互作的WRKY2，与MBS互作的MYB9。并将ThERF启动子上含有GCC-BOX, WBOX或MBS（MYBcore）元件的片段克隆到pHIS2中，同时将相应的启动子片段元件分别进行缺失和突变，用酵母单杂交分别研究其与ERF10、WRKY2和MYB9的互作，结果表明这三个基因分别能与含有GCC-BOX、WBOX或MBS元件的片段互作，但这些元件片段缺失或突变后则不能互作，说明ERF10、WRKY2和MYB9通过识别GCC-BOX, WBOX和MBS元件调控ThERF的表达。将ThERF转入拟南芥中，发现转ThERF基因拟南芥的抗旱、耐盐耐及ABA能力明显较野生型减弱，通过NBT、DAB及H2DCF-DA染色显示，转基因植株在逆境胁迫积累的ROS明显较野生型多。伊文思蓝染色显示逆境下转基因植株的细胞膜受损程度明显增加。进一步的研究发现，在盐、旱及ABA逆境下，转基因植株的SOD、POD活性减弱，相对电导率及MDA含量升高，也进一步说明了ThERF的过表达能够导致转基因植物的SOD、POD活性降低，从而导致其积累的ROS升高，进而使得细胞膜受损。利用Agilent 拟南芥表达谱芯片研究了转ThERF基因拟南芥和野生型拟南芥在非胁迫和盐胁迫下的基因表达情况。结果表明，在非逆境胁迫下，与野生型拟南芥相比，上调表达的基因有303条，下调表达的基因有107条；在盐胁迫下，与野生型拟南芥相比，上调表达的基因有154条，下调表达的基因有307条。这些基因为ThERF所调控的下游靶基因，对这些基因的研究，有助于揭示ThERF所调控的植物对逆境胁迫响应机理。