中国野生毛葡萄转录因子VqWRKY3抗黑痘病的功能分析与调控机制研究

Anthracnose is one of the most important grape diseases with high incidence in a wide range and very serious effect on the quality and yield of grape fruits in the south and north grape production area of China. An economic and effective method was used to create resistance germplasm resources by utilizing resistance gene resources of its own. We obtained a transcription factor induced by Elsinoe ampelina from resistance grape ‘Shang-24’ based on previous data of suppression subtractive hybridization (SSH) and transcriptome sequencing. We will obtain ‘Red globe’ (Susceptible grape) over-expression lines through agroinfiltration and ‘Shang-24’ (Resistant grape) slience lines by virus induced gene silencing (VIGS)，respectively. The functional analysis of VqWRKY3 will be preformed by disease assays, histopathology, expression of defense-related genes, and biochemical measurement. In addition, Yeast one-hybrid and ChIP-Seq assays were used to find the upstream regulation genes and downstream target gene of VqWRKY3, respectively. The candidate genes were confirmed by EMSA assay in vitro. Thirdly, the promoter activity of VqWRKY3 will be preformed by transient expression assays in grapevine to investigate the response pattern after treatment with Elsinoe ampelina, SA, and JA. The aim of this project is to provide gene resources for grape molecular breeding and to provide solid foundation for genetic improvement of grape.

葡萄黑痘病在我国南北多雨地区都有大量发生，严重影响葡萄的产量和品质。利用野生葡萄自身的抗病基因资源，创制抗病优质葡萄新种质是最经济有效的措施之一。课题组前期通过抑制差减杂交和转录组分析从抗病材料中国野生毛葡萄‘商-24’中筛选到一个受黑痘病菌诱导的转录因子VqWRKY3。本项目拟通过超表达对葡萄感病品种‘红地球’进行遗传转化和VIGS技术对抗病材料‘商-24’进行诱导沉默，结合组织病理学、防御相关基因表达以及生理生化指标测定探讨VqWRKY3在抗葡萄黑痘病中的生物学功能；其次，通过酵母单杂和染色质免疫共沉淀筛选其上游调控基因和下游靶基因，利用凝胶阻滞实验进行体外验证，明确VqWRKY3基因的调控机制。再者，通过启动子活性分析，探讨VqWRKY3基因启动子在葡萄黑痘病菌、茉莉酸和水杨酸处理下的响应情况。本项目的开展，旨在为葡萄抗病分子育种提供基因资源，为葡萄品种改良提供理论基础。

葡萄黑痘病是由痂囊腔菌（Elsinoë ampelina）引起的一种真菌性病害，主要危害葡萄的幼嫩组织，如幼叶、叶柄、幼茎、卷须和幼果，是葡萄生产中的主要真菌病害之一，发病严重时可影响葡萄植株的正常生长和果实的品质及产量。课题组在前期的研究中，通过抑制差减杂交和转录组测序分析，从抗病材料中国野生毛葡萄‘商-24’中筛选到一个受葡萄黑痘病菌诱导表达的转录因子VqWRKY3。该基因长度为570 bp，编码 188 个氨基酸，在根和卷须中的表达量较高，在花中的表达量次之，而在嫩茎、叶和果实中的表达量较低；病原菌处理后，VqWRKY3 在葡萄叶片中的表达开始上调，处理后24 h的基因表达量达到峰值，随后基因表达开始逐渐下降，至 120 h 时恢复至对照水平，说明 VqWRKY3 的表达响应葡萄病原菌处理。为进一步探讨其抗病功能，采用农杆菌法获得T3代拟南芥超表达植株。与野生型相比，转VqWRKY3基因拟南芥株系表现出较强的抗病性，具体表现为转基因植株的真菌孢子数显著低于野生型。转基因植株中PDF1.2、PR1、NPR1和LOX3抗病相关基因均可受病原菌诱导上调表达，说明VqWRKY3介导的抗病性与SA途径相关。亚细胞定位发现VqWRKY3基因定位于细胞核，并且具有转录自激活活性。另外，葡萄黑痘病菌在PDA培养基上培养25天，在21℃下黑暗诱导24 h，每个菌落产生的真菌孢子数可达5×106个/mL。组织病理学观察发现葡萄黑痘病菌在接种后48 h开始侵入叶片表皮细胞，随后在胞间扩展，72 h观察到穿透细胞壁进入胞内。接种后6 d在叶片表面形成分生孢子盘并产生新的分生孢子。基因组测序发现葡萄黑痘病菌的基因组为28.2 Mb，编码8057个基因，包括407个碳水化合物酶基因、158个细胞壁降解酶基因、555个病原与宿主相互作用的基因、164个次生代谢物合成基因和103个候选效应蛋白。综上，中国野生毛葡萄VqWRKY3可以为葡萄抗病分子育种提供基因资源，增强葡萄的抗病性；建立的诱导产孢体系、组织病理学观察和真菌基因组解析将为深入研究病葡萄黑痘病菌-葡萄互作关系奠定了重要基础。