肉牛肌内脂肪相关microRNAs的分离及其在肌内前体脂肪细胞分化中的调控机制

肌内脂肪含量是评价牛肉品质的重要指标，其形成受多种因素如营养、基因等的调控。微小RNA（miRNAs）是一类新发现的非编码小RNA，研究发现其对动物脂肪形成有重要的调控作用。但目前有关miRNAs在牛肉质调控领域尚属空白。因此，本研究拟采用miRNAs表达谱芯片、stem-loop qRT-PCR结合生物信息学等技术筛选、鉴定肉牛肌内脂肪特异性表达的miRNAs。以已获得的肉牛肌内前体脂肪细胞为实验材料，通过miRNAs基因沉默技术抑制筛选的miRNAs在肉牛肌内前体脂肪细胞中的表达，应用细胞化学染色、荧光定量-PCR、Western blot、Nothern blot等方法分别研究特异性miRNAs对肉牛肌内前体脂肪细胞分化的作用及调控的靶基因，初步探索miRNAs在肉牛肌内脂肪生长、发育过程中的作用及其调控机制，为进一步揭示肉牛不同部位脂肪沉积规律、改善肉质奠定理论基础。

肌内脂肪含量是评价家畜肉品质的重要指标。本项目以牛为实验动物，从2010年起至2013年12月按项目研究计划圆满完成了项目涉及的研究内容，主要研究成果如下：采集了牛（西门塔尔牛）皮下脂肪及第6-7根肋骨间的肌内脂肪组织，分别提取两种脂肪组织中的总RNA用于芯片实验；miRNA表达谱芯片杂交实验（经过生物素标记MiRNA、芯片杂交、芯片清洗染色、扫描等步骤后，采用Lowess*方法对芯片数据进行归一化，并基于归一化后数据进行t-Test和Cluster分析）筛选牛皮下脂肪和肌内脂肪差异表达的miRNA，同时考虑以下因素：①p-value < 0.01；②样品两两比较的差异倍数建议 >= 4（即|log2| >= 2），至少 >2（即|log2|>1）；③两样品中，较强的杂交信号值 >= 2000。结果：在213个表达的miRNAs中发现了88个差异表达的miRNAs，其中有30个miRNAs在皮下脂肪和肌内脂肪中达到差异极显著水平（P<0.01）；根据以上三个条件，对11个候选miRNAs进行 RT-qPCR验证。结果在11个候选差异表达的miRNA中，10个与芯片结果相一致，说明芯片结果可信度相对较高，而miRNA-143、miRNA-145、miRNA-140及miRNA-27b等在肌内脂肪中高表达；采用TargetScan软件对候选的miRNA进行靶基因预测，发现每个miRNA至少对应2个及以上靶基因，而这些靶基因基本都是与脂肪代谢、分化的基因；对目标miRNAs进行了GO和KEGG的富集性分析，显示目标miRNA的预测靶基因在MAPK、Wnt、Hedgehog、TGF-beta、GnRH等信号通路中显著富集，其中在MAPK信号通路中富集度最高。. 采用“天花板”培养方法体外培养了牛肌内前体脂肪细胞，合成了候选miRNA-143的抑制剂，将其稳定转染至牛肌内前体脂肪细胞中，发现肌内前体脂肪细胞分化过程中miRNA-143表达量逐渐升高；抑制miRNA-143的表达，可以抑制肌内前体脂肪细胞分化及细胞内脂肪的积聚，脂肪分化关键基因C/EBPa及FABP-4的表达量减少，说明miRNA-143至少是通过C/EBPa及FABP-4来调节肌内脂肪的形成。