Klebsiella pneumoniae 2e甘油脱水酶高耐受粗甘油的分子机制研究

Crude glycerol is largely generated as the main by-product of the biodiesel industry. The direct bioconversion of crude glycerol into 1,3-propanediol by microorganisms is a promising alternative for effective and economic utilization. However, the low activity of key enzymes in microbial fermentation process affected by the impurities from crude glycerol hinders its industrial application. A bacterial strain Klebsiella pneumoniae 2e with capacity to efficiently produce 1,3-propanediol from crude glycerol was obtained from soil samples contaminated by waste residue of biodiesel production in our previous study. We found that the glycerol dehydratase of K. pneumoniae 2e exhibited high tolerance to crude glycerol. Based on these results, we plan to conduct the following studies to explore the molecular mechanism of this glycerol dehydratase with high tolerance to crude glycerol in this project. Firstly, investigate the protein functional structure and enzymatic characteristics involved in tolerance of its glycerol dehydratase and corresponding reactivation factor by bioinformatics, molecular biological and enzymatic analysis. Then screen the expression regulatory factor of glycerol dehydratase genes and explore its regulatory model, to uncover its expression regulatory mechanism of K. pneumoniae 2e in crude glycerol environment. The results of this research will provide the theory for developing the engineered strain and promoting the industrial 1,3-propanediol production with crude glycerol by fermentation.

粗甘油是生物柴油工业生产中的主要副产物，通过微生物发酵直接将其转化成高值化学品1,3-丙二醇，是其绿色高值化利用的有效途径。受粗甘油所含杂质的影响，微生物发酵过程中关键酶活力低下问题阻碍了其工业应用。申请者前期从取自生物柴油生产废渣污染区域土样中，分离筛选出一株粗甘油高产1,3-丙二醇的细菌Klebsiella pneumoniae 2e，并发现其合成1,3-丙二醇途径中的关键限速酶-甘油脱水酶具有高耐受粗甘油的特性。本项目拟在此基础上，采用生物信息学、分子生物学、酶学等方法，解析该菌甘油脱水酶及其再激活因子与耐受相关的蛋白质功能结构特征、酶学特性，并通过对该菌甘油脱水酶表达调控因子的筛选及作用模式研究，揭示该菌在粗甘油环境中对其甘油脱水酶基因的表达调控机制，以阐明该菌甘油脱水酶高耐受粗甘油的分子机制。研究结果将为开发相应的工程菌株并促进粗甘油发酵生产1,3-丙二醇的工业应用提供理论依据。

甘油脱水酶是甘油代谢途径中控制甘油分解和1,3-丙二醇生成的关键性限速酶，对1,3-丙二醇的合成速率和产率起着至关重要的作用。前期研究表明来源于Klebsiella pneumoniae 2e甘油脱水酶具有粗甘油耐受性。本项目针对该酶对粗甘油的耐受分子机制开展了深入探究，获得以下主要结果：1）解析了K. pneumonia 2e甘油脱水酶的蛋白结构与酶学特性。该菌甘油脱水酶蛋白结构与以往报道的甘油脱水酶结构不同，其六聚体结构主要由α连接而成。该酶催化甘油的Km和Vm分别为3.42 mM和58.15 nkat·mg-1，其最适pH和温度分别为7.0和37℃。该酶的温度和pH稳定范围分别为25-37℃与6.0-8.5，均比文献报道的甘油脱水酶适应范围更宽。吐温20和Fe2+能显著促进该酶的活性，分别可提高294%和290%。2）明晰了K. pneumonia 2e甘油脱水酶对粗甘油主要杂质的耐受特性。甲醇在7.5%-12.5%的浓度范围内，对2eGDHt的活性具有显著的促进作用。NaCl在2%-8%范围内对2eGDHt活性无显著性影响。而油酸和亚油酸的添加浓度低于1% (v/v)时，其对该酶活性影响较小。将上述杂质按照粗甘油含量比率混合添加后对该酶的活性几乎没有影响。该酶蛋白结构α亚基上的315位精氨酸对该酶在粗甘油中的活性维持起着关键作用。3）探明了K. pneumonia 2e甘油脱水酶基因表达调控机制。筛选并鉴定出甘油脱水酶基因表达的转录激活因子H-NS。该蛋白编码基因的缺失能显著抑制该菌在甘油发酵中甘油脱水酶基因的表达，导致菌体生长减慢，其甘油脱水酶活性、3-羟基丙醛和1,3-丙二醇的产量均显著降低。H-NS是通过与甘油脱水酶基因启动子序列直接结合来正向调控其表达，其结合启动子序列是一段长度为145 bp富含AT的区域。与纯甘油相比，H-NS能响应粗甘油显著上调甘油脱水酶基因的表达。同时，H-NS在粗甘油和纯甘油中的表达水平无显著性，其可能是通过蛋白多聚体状态的变化或者蛋白磷酸化、乙酰化等修饰来调控甘油脱水酶的表达。本研究结果将为解决细菌发酵粗甘油过程中甘油脱水酶活力低下的实际问题提供科学依据，对促进粗甘油生物转化的工业化应用有着重要意义。