聚羟基丁酸途径增强Klebsiella pneumoniae抗逆性机理研究

3－羟基丙醛积累造成细胞死亡，发酵异常终止是生物法生产1,3-丙二醇过程中的关键问题。申请者在前期工作基础上，不同于以往降低3－羟基丙醛积累的研究思路，从增强菌株自身抗逆性出发，将聚羟基丁酸（PHB）途径引入Klebsiella pneumoniae，研究PHB途径对细胞代谢的扰动规律，探讨PHB积累与菌株抗逆的相关性；研究rpoS基因对细胞PHB代谢的调节机制，考察PHB积累对细胞DNA合成的影响，揭示PHB积累增强菌株抗逆性的内源因素；结合蛋白组学分析及基因差异分析研究PHB积累对K.pneumoniae蛋白合成的调节机制，从而阐明PHB途径增强K. pneumoniae抗逆性机理。本研究结果可为耐高浓度3-羟基丙醛菌种的进一步改造及优化提供理论依据；对解决3-羟基丙醛积累造成1,3-丙二醇发酵过程异常中断的难题具有重要的理论指导意义。

3-羟基丙醛（3-HPA）积累造成细胞死亡，发酵异常终止是生物法生产1,3-丙二醇（PDO）过程中的关键问题。本项目研究了3-HPA对克雷伯氏菌代谢的影响及聚羟基丁酸（PHB）路径的引入增强克雷伯氏菌抗逆性的机理。.首先研究了克雷伯氏菌对3-HPA的耐受性并探讨了其酶学机理。低浓度3-HPA积累可促进菌体生长；高浓度3-HPA积累时，甘油脱水酶活力提高一倍，甘油脱氢酶和PDO氧化还原酶活力降低了33.3%和37.5%，从而导致3-HPA积累。以选育的PDO高产菌为模式菌株，优化了phbCAB基因的表达并获得稳定转化子，工程菌耐3-HPA浓度可达 10.8 mmol/L。.研究了PHB路径对克雷伯氏菌代谢的扰动，并对关键节点代谢流分布进行了差异分析。PHB路径引入后，一部分碳流量流向了PHB合成，而流向细胞前体物质合成的流量减少。PHB路径主要影响节点丙酮酸（PYR）和乙酰辅酶A (AcCOA)的代谢流分布。节点PYR流向乳酸合成的碳流量增加了1.79倍，而流向2,3-丁二醇和AcCOA的碳流量则分别下降了22%和14.4%。在节点AcCOA，流向乙醇合成的流量增加了42.8%，而流向乙酸合成的流量降低了12.4%。.结合代谢流分析和酶活分析的结果，进行了ldhA基因敲除，同时转入phbCAB基因。流加发酵48h，工程菌PDO产量较对照提高8.6%，无乳酸合成。ldhA 基因敲除后，PHB路径主要影响节点甘油和AcCOA的代谢流分布。在节点甘油处，流向PDO合成的碳流量增加了5%，而流向生物量和磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）合成降低了10.7%和7.5%。在节点AcCOA，流向乙醇合成的碳流量增加了20.1%，而流向乙酸合成的则降低了6.9%。 ldhA基因敲除后，部分NADH2为PDO所利用，因此在保持较高抗逆性的同时PDO的合成也得到了促进。.进行了蛋白组学研究以进一步了解雷伯氏菌对3-HPA的耐受机制，高浓度3-HPA积累时，出现3倍差异蛋白14个，新出现蛋白15个，与糖酵解途径，甘油脂代谢，醇代谢等途径相关。高浓度3-HPA积累时，显著上调的蛋白有3-磷酸甘油脱氢酶，PEP合酶，葡萄糖磷酸变位酶。相反，腺苷钴胺依赖的二醇脱水酶，甘油脱氢酶，磷酸甘油酸激酶，磷酸丙酮酸水合酶显著下调。研究结果为耐高浓度3-HPA菌种进一步改造及优化提供了理论依据。