细胞自噬相关蛋白Atg4B识别和酶切LC3-PE的分子机制研究

Autophagy is a cell-based biological process that is unique to eukaryotic cells and that degrades intracellularly damaged organelles and long-lived proteins by the lysosomal pathway. Abnormal regulation of autophagy leads to a range of diseases, such as aging, cancer and neurodegenerative diseases. Atg4B regulates the process of autophagy by mediating the transformation of proLC3 to LC3-I and delipidation of LC3-PE. However, the molecular mechanism of LC3-PE delipidation by Atg4B is unclear. In the present study, the catalytic efficiency of Atg4B for proLC3 and LC3-PE will be tested using chemically synthesized lipidated protein LC3-PE as a tool; the effect of the fatty acid chain and membrane on Atg4B recognition also will be explored; It will be verified that Atg4B has LC3-PE association region and the how Atg4 utilizes its unique region to regulate the delipidation of LC3-PE. The present study is expected to reveal the molecular mechanism of Atg4B recognition and cleavage of LC3-PE, and to establish a working model of Atg4B. The results will help us to better understand the molecular mechanism of autophagy, and it has implications in providing a scientific basis for the development of new Atg4 inhibitors.

细胞自噬是真核细胞所特有的对细胞内受损细胞器及长寿命蛋白通过溶酶体途径进行降解的细胞生物学过程。自噬异常调节会导致一系列的疾病，例如衰老、癌症和神经退行性疾病等。自噬相关蛋白Atg4B通过介导的proLC3至LC3-I的转化以及LC3-PE的去脂基化，调控整个自噬的进程，但Atg4B识别和酶切LC3-PE分子机制目前还不清楚。本项目拟利用化学合成的脂基化蛋白LC3-PE作为工具，研究Atg4B对底物proLC3和LC3-PE酶切效率的差异，探究脂肪酸链及其膜存在的条件下Atg4B酶切活性的变化，验证Atg4B存在特异性识别脂基化蛋白LC3-PE的结构域，及Atg4B是如何利用其独特的结构域调控LC3-PE的去脂基化。项目预期将揭示Atg4B识别和酶切LC3-PE的分子机制，建立Atg4B酶活性的调控模型，项目研究成果将拓展我们对自噬分子机理的认识，为开发新型Atg4B抑制剂提供科学依据。

细胞自噬是依赖溶酶体途径对胞质蛋白和细胞器进行降解的一种过程，在进化上具有高度保守性，广泛存在于从酵母、线虫、果蝇到高等脊椎动物的细胞中。细胞自噬细胞自噬是生物有机体适应不同环境的有效的内部调节机制。自噬异常会导致一系列的疾病状态,如神经退行性疾病、感染性疾病、癌症和衰老等。因此，研究细胞自噬的分子机制，有助于拓展对细胞自噬的认识，进而为相关疾病治疗提供新的药物靶标和科学依据。在细胞自噬中，有多种自噬相关基因（Autophagy-related genes，Atg）相互作用参与细胞自噬的调控。自噬相关蛋白Atg4B通过介导的proLC3至LC3-I的转化以及LC3-PE的去脂基化，调控整个自噬的进程，但Atg4B识别和酶切LC3-PE分子机制目前还不清楚。本研究探究了Atg4B识别和酶切LC3-PE生化机制及Atg4B酶活性调控机制。主要取得以下研究成果：1、哺乳动物Atg4B对底物proLC3和脂基化蛋白LC3-PE具有不同的活性；2、酵母Atg4通过APEAR区域与脂基化蛋白Atg8-PE相互作用，且APEAR只参与脂基化蛋白Atg8-PE的识别和切割，而哺乳动物细胞Atg4B APEAR保守区对未修饰蛋白LC3酶切效率降低，说明哺乳动物细胞Atg4B与酵母Atg4虽然在结构上有高度保守型，但两者对脂修饰蛋白的识别和酶切机制有差异；3、利用蛋白重组技术和多肽固相合成方法，结合蛋白质化学连接技术，制备磷酸化修饰的Atg4BS383Pi和Atg4BS392Pi。再利用生物化学方法，对比磷酸化修饰的Atg4B蛋白与非磷酸化修饰的Atg4B蛋白对底物proLC3和LC3-PE酶切效率的差别，结果显示Atg4BS383Pi和Atg4BS392Pi参与底物的识别与酶切、4、建立了棕榈酰化修饰的检测体系，发现Atg4B蛋白在细胞内是被棕榈酰化的，进一步研究结果显示，棕榈酰化修饰调控Atg4B的膜定位，进而影响蛋白酶活性，尤其调控Atg4B介导的LC3-PE去脂基化修饰的过程。总之，我们的研究结果揭示了Atg4B识别和酶切LC3-PE的新的分子机制，建立Atg4B酶活性的调控模型。