利用基因工程细胞联合RNA干扰沉默技术促进自身免疫性脑脊髓炎突触和髓鞘重塑的研究

Our previous study found that OECs-NT-3 genetically engineered cells could secret endogenous NT-3 constantly after implantation into experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE).Myelin sheath repaired well in a short time. Then “abortive regeneration phenomenon” appeared which was relative to the overexpression of Lingo-1 gene. In the study, Lingo-1shRNA lentiviral vectors were constructed to silence the expression of Lingo-1 gene. Simultaneously, OECs-NT-3 genetically engineered cells were transplanted into EAE mice in addition to Lingo-1 gene silencing.The transplanted cells were tracked in vivo to catch the migration direction, the differentiation behavior, chemotaxis and synaptic establishing situation. By means of the microstructure observation, somatosensory evoked potentials, retrograde tracer tag technology and flow cytometry, our study aims to resolve the problem “abortive regeneration” , to activiate the plasticity of nerve by the endogenous differentiation of transplanted cells and to realize the reconstruction through the effective signal conduction and networking with cells in vivo.

我们的前期研究发现:OECs-NT-3基因工程细胞移植入自身免疫性脑脊髓炎（EAE）后,可持续恒定地分泌内源性神经生长因子-3(NT-3),且在短时间内髓鞘修复良好,但继而出现的“夭折性再生现象”是远期髓鞘再生不良的重要原因,并证实了其与宿主内Lingo-1 基因的过度表达有关。本研究应用基因工程技术,构建Lingo-1shRNA慢病毒载体干扰沉默少突胶质细胞的Lingo -1 基因,敲除其负性调控作用后,联合OECs-NT-3移植入EAE小鼠;通过在体示踪方法,研究移植细胞的迁徙、分化、趋化性及突触建立情况;通过对髓鞘及轴突的微观观察、皮层体感诱发电位、逆行示踪标记技术、流氏细胞学等方法，探索解决移植细胞如何在实现内源NT-3持续分泌的前提下,消除“夭折性再生”这一难题;以及如何通过移植细胞的内源性分化,启动可塑性机制,与在体细胞建立有效的信号传导和突触连接,以实现真正的神经重塑。

研究背景: 多发性硬化是中枢神经系统的自身免疫性疾病，病理特征是少突胶质细胞丢失，髓 鞘脱落。促进髓鞘再生能够明显改善MS病人预后，本研究探索观人脐带间充质干细胞来源外泌体（hucMSC-exo）对少突胶质前体细胞（oligodendrocyte precursor cells., OPC）成熟分化的影响以及对自身免疫性脑脊髓炎(Experimental allergic Encephalomyelitis, EAE)的治疗作用并探讨其可能的机制。 .研究方法：1.采用组织细胞贴壁原代培养的方法提取细胞，自人脐带提取hucMSC，细胞传代至第四代，利用差速离心从hucMSC培养基提取外泌体，并测定提取的颗粒指标是否符合hucMSC-exo的特征 ；2.不同浓度hucMSC-exo与OPCs共培养，对共培养后的细胞进行增殖指标及分化指标检测，观察不同浓度hucMSC-exo对OPC增殖分化能力的影响；3.从运动功能学评分及髓鞘染色等方面，观察静脉注射hucMSC-exo对EAE髓鞘修复与再生的影响。 .结果：1.人脐带组织贴壁后，接种至培养瓶，10d后可见大量间充质干细胞细胞爬出，细胞呈集落样成长，可见明显的长梭形，呈鱼群样分布。人间充质干细胞培养基提取的颗粒呈hucMSC-exo 的 特征，WB检测显示 hucMSC-exo 表达 TSG101、Cd63和 Cd81；电镜 100nm 左右典型的茶托样外泌体颗粒；纳米粒径示：hucMSC-exo粒径为 128.5nm；2.不同浓度hucMSC-exo与OPC共培养，与对照组相比，3μg/ml外泌体组的髓鞘蛋白无明显差异，当外泌体浓度≥12.5μg/mL时，OPC的髓鞘蛋白表达量明显增高，相对应的不同浓度hucMSC-exo对OPC的增殖能力没有明显差异。3.外泌体处理EAE，单位面积内髓鞘损伤情况低于对照组，运动评分均明显高于对照组组。 .结论与意义：1.利用差速离心提取hucMSC培养基内的外泌体，符合HucMSC-exo的基本特征； 2. 一定浓度的hucMSC-exo与间充质干细胞共培养，突起数量明显增多，髓鞘成熟两个标志蛋白MBP和CGT明显增多，提示hucMSC-exo有利于促进OPC成熟分化，有利于受损的神经轴突修复，改善神经冲突的传递；3.相对于对照组，尾静脉注射hucMSC-exo明显改善EAE模型的