前梯度蛋白与雪旺氏细胞在蝾螈肢体再生启动过程中的协同作用研究

Salamander possesses excellent ability to completely regenerate amputated limb through the mediation of blastema, which undergoes substantial cell proliferation and patterning to replace the amputated part. Limb regeneration in salamander is nerve-dependent, furthermore, ectopic limb formation could be induced when a nerve is deviated to a skin wound on the side of a limb concomitantly with is a piece of skin graft from the contralateral side. It has been demonstrated that anterior gradient protein（AG）was sequentially expressed after amputation in Schwann cells of the regenerating limb, while its expression was abrogated by denervation. Importantly, the regeneration of denervated limb could be rescued after electroporation of AG at the stump end. However, the derivation, biological effect and relationship of AG with local cells remained unclear. We hypothesized that the existence of Schwann cells and local expression of AG are triggering elements for limb regeneration, and could be applied for the fabrication of tissue engineered blastema. To demonstrate the hypothesis, in the current experiment we will seed expanded salamander Schwann cells into collagen beads in combination with the delivery of recombinant AG, to fabricate tissue engineered regenerating blastema and induce ectopic limb formation in salamander. The results of our study would be essential for the discovery of necessary and sufficient elements for limb regeneration.

蝾螈具有突出的再生能力，肢体切除后可以完整再生，而且通过神经断端的转位可在异位诱导出新的肢体。芽基是蝾螈肢体再生的关键，多种细胞成分和信号分子参与了其形成。现有的研究表明蝾螈肢体再生是神经依赖性的，肢体离断后神经断端的雪旺氏细胞会有前梯度蛋白（AG）的表达，失神经支配的肢体离断后不再表达AG并丧失再生能力，而在局部电转染AG后可恢复再生能力。但AG对肢体断端附近细胞的效应，以及AG是否需要与断端部位的特定细胞共同作用才能启动肢体再生，目前还不清楚。本项目提出雪旺氏细胞和局部表达AG是蝾螈肢体再生的关键条件，二者共同作用才能启动蝾螈肢体再生。研究拟通过克隆AG、进行真核表达，观察AG及雪旺氏细胞的生物学效应；结合雪旺氏细胞培养、接种和AG的使用，构建组织工程肢体再生芽基并进行异位肢体诱导再生，证实雪旺氏细胞和局部表达AG是肢体再生的启动因素。研究结果对于阐明蝾螈肢体再生机理具有重要的意义。

蝾螈具有极强的再生能力，肢体离断后断端附近的细胞可以去分化重新进入细胞周期，并移行、聚集形成肢体再生的重要结构-芽基，芽基内的细胞通过增殖、分化进而再生出整个肢体。蝾螈肢体再生是神经依赖性的，失神经支配的肢体丧失再生能力，通过外周神经转位还可诱导异位肢体再生。前梯度蛋白（AG）是具有调控细胞增殖功能的信号分子，研究表明肢体离断后神经断端有AG表达，断端局部进行AG转染后失神经肢体可恢复再生能力，但AG对断端附近细胞的生物学效应以及需要何种细胞协同诱导肢体再生还不清楚。本项目提出雪旺氏细胞和局部表达的AG是蝾螈肢体再生的关键条件，二者协同作用可启动肢体再生。我们首先建立蝾螈断肢再生模型，通过转录组测序和qRT-PCR检测断肢后神经组织的基因表达差异，发现AG在断端神经组织并无转录表达，其表达位于上游脊髓背根神经节中，可能通过轴突运输至断肢部位；进一步构建AG重组蛋白真核表达系统，进行AG的表达和纯化，生物学效应检测发现其还具有明显的细胞趋化作用，局部电转构建的AG真核表达载体，可使高位离断神经后的肢体恢复再生能力；最后建立异位肢体再生模型，观察AG和雪旺氏细胞对再生芽基形成的作用，发现局部单独移植缓释AG的明胶微粒（或电转AG真核表达载体）和雪旺氏细胞均无法诱导芽基形成，而联合移植则可以形成明显的芽基结构，但不能进一步发育成完整的肢体。本项目的结果表明中枢神经系统产生的信号分子可通过轴突运输至肢体断端而发挥生物学效应，证实AG和雪旺氏细胞的协同作用可以启动蝾螈肢体再生过程的芽基形成，为进一步开展肢体诱导再生提供了依据。