组织工程皮肤的干燥保存技术研究

组织工程是未来进行组织缺损修复最有效的方法，但现有的保存技术对组织工程产品的有效保存时间较短，远不能满足临床需要。海藻糖对干燥状态下的生物体具有保护作用，应用这一特性，本项目提出了组织工程皮肤干燥保存的设想。首先对种子细胞中稳定负载海藻糖的条件进行优化，针对干燥保存与种子细胞表型关系这一关键科学问题，深入研究海藻糖和干燥过程对种子细胞分泌生长因子和细胞外基质的影响， 进一步结合观察组织活性、移植修复皮肤缺损效果等，探索出海藻糖和冷冻保护剂的使用方法，解决组织工程皮肤干燥保存的关键方法。干燥的组织工程皮肤能够长期稳定保存，复水后迅速恢复细胞活性和表型用于移植。该方法目前未见文献报道，研究如果获得成功将具有重要的科学价值和应用价值。

组织工程皮肤具有良好的皮肤缺损修复效果。然而，产品的生产周期较长，且含有活细胞，其有效保存的时间严重限制了其临床应用和产业化，因此迫切需要寻找新的有效的保存方法。海藻糖是一种非还原性二糖，越来越多的研究发现海藻糖对干燥状态下的生物体具有保护作用。我们设想先将种子细胞负载海藻糖和DMSO再构建组织工程皮肤，利用海藻糖保护细胞在干燥条件下存活，DMSO保护细胞在程序降温和冷冻过程中存活。在此基础上将组织工程皮肤低温冻结，并在真空条件下使其水分升华而成为干燥状态。这样就可以为组织工程皮肤的长期保存提供了一种新的方法——冷冻干燥保存，既可以使TES能够稳定储存，也在复水恢复活性的过程中避免冰晶损伤，目前未见文献报道。.本研究中，我们优化了海藻糖负载种子细胞成纤维细胞的条件并评估了负载海藻糖的成纤维细胞干燥保存的效果。随后，我们用负载海藻糖的成纤维细胞与鼠尾胶原凝胶构建了组织工程皮肤，将其冷冻干燥后，进行了一系列显微、超微结构观察，荧光染色，活力测定以及皮肤缺损修复实验，评价冷冻干燥保存方法对组织工程皮肤的保存效果，最终期望建立组织工程皮肤保存的新方法。结论如下：1. 我们从保存液中海藻糖的浓度，孵育时间和孵育温度三个方面优化了成纤维细胞负载海藻糖的条件，获得最佳导入条件为200mM，在37℃条件下孵育8h。在此条件下负载海藻糖的细胞，经过冷冻干燥过程后仍可保存30%的活性，经过人工风干过程可保留40%的活性，荧光染色及电镜观察显明细胞膜基本保存完整，膜内部分线粒体和内质网得到了有效的保存。海藻糖的确在干燥过程中有利于细胞活性的保存。2. 我们用负载海藻糖的细胞成功构建了组织工程皮肤。经过冷冻干燥保存后，组织工程皮肤仍保留有26%的活性；SEM显示组织工程皮肤的结构基本保持完整；在C57BL/6J小鼠背部全层皮肤缺损修复中，负载海藻糖的组织工程皮肤伤口愈合速度较没有负载海藻糖的组别提高了约1/3，而与正常组织工程皮肤无明显差别。利用海藻糖的干燥保护作用而引入的冷冻干燥保存，的确有效保护了组织工程皮肤的活性并利于其缺损修复效果的发挥，为组织工程皮肤的保存提供了新的思路。