SUMO化途径靶向抗肿瘤中草药筛选模型的建立及应用

The research on the basis of privious work, which CyPet and YPet FRET pair fuse SUMOylation pathway proteins were used for high-throughput screening for anti-tumor compound.Here we decide to optimize the privious method to resolve dimerization of CyPet/YPet FRET pair. Combined with the characteristics of Chinese herbal medicine, which composition is complex, the Chinese herbal medicine screening model for anti-tumor will be constrcted and the sites for dimerization will be mutated, then the extression vector of CyPet/YPet fuse SUMO,its substrate and the enzymes E1(Aos1/Uba2)、E2(Ubc9) which catalize the muti-step reaction will be constrcted.After that, we will determine the activities of SUMOylation pathway proteins since mutated FRET fused,also the changes of activities should be detected.An optimized screening model should decrease the crosstalk from FRET pair.A Chinese herbal extraction library for high-through put screening will also be construted for the application of the optimized screening model.The purpose is that at least one kind of anti-tumor herbal should be obtained.All this work may put a new sight on screening chinese medicine of targeted diseases.

在前期研究已阐明CyPet/YPet荧光对融合SUMO化途径蛋白可以用于荧光共振能量转移法高通量筛选抗癌药物单一化合物的基础上，本研究拟突变荧光对，解决CyPet/YPet在荧光共振能量转移时的二聚化问题，以SUMO化途径蛋白为靶标，结合中草药成分复杂的特点，建立适合中草药抗肿瘤筛选模型。突变与CyPet/YPet形成二聚体的相关位点，融合SUMO与其底物的基因表达载体和催化级联反应酶E1（Aos1/Uba2）、E2（Ubc9）的基因表达载体，经免疫印迹分析验证SUMO化途径蛋白的活性，并测定重组荧光蛋白前后底物SUMO化活性变化情况，获得优化的筛选模型，消除荧光对自身相互作用时的二聚体信号干扰。构建中草药提取物库用于筛选模型的应用。力图筛选到至少一种以SUMO为靶点的抗癌中草药，为中草药与疾病靶向筛选提供新方法。

应用于临床的抗肿瘤药物存在选择性差、毒副作用大、易产生耐药性等问题，继续寻找选择性高、毒副作用小、针对单一靶位点的抗癌药是抗肿瘤新药研究的重点。如何进行药物初筛是工作的一个重要环节。本项目以SUMO（small-ubiquitin modifier，类泛素修饰）化途径蛋白为模型，利用荧光共振能量转移技术建立了高通量抗癌中草药的筛选方法。为中草药抗癌药物筛选提供了新思路。研究内容及结果如下（1）将CyPet/YPet中的207位点A改造为K。突变后的荧光蛋白与SUMO基因和底物RanGAP基因融合，建立大肠杆菌体外表达系统。Western Blot分析结果表明突变荧光对融合的SUMO化途径蛋白具有活性。对比ECFP/EGFP荧光对，CyPet/YPet荧光对FRET信号更灵敏。（2）利用CyPet/YPet FRET对，成功建立了CyPet发射波长信号猝灭与Kd参数的转化体系和定量分析方法。这个方法区别于本课题组先前建立的的YPet发射波长变化的定量分析方法。为采用多样化的方法，寻找SUMO化通路抑制剂奠定了基础。（3）中药成分杂，粗提的中药含有蛋白、多糖等成分，这些成分对于筛选方法要求很高，本实验建立的FRET信号转化体系中，SUMO化途径中蛋白的相互作用，即使反应体系中有杂蛋白的掺入，只要杂蛋白浓度在一定范围内，且杂蛋白不作为SUMO化途径抑制剂，Kd结果非常稳定。反应体系加入杂蛋白的实验，证明了此抗肿瘤中草药筛选方法对于中草药粗提物作为初筛样品的优势。（4）获得了100余种中草药粗提产物，应用所构建的筛选方法进行SUMO化通路抑制剂筛选。对筛选结果整合分析，发现中草药中四个粗物也显现出对SUMO化途径的抑制，在SUMO途径中的抑制靶点仍需深入研究。