建立抗疱疹病毒中草药提取物的AN高通量分子筛选模型

传统筛选抗疱疹病毒药物多用"细胞模型"或"动物模型"，但成本高，且耗时费力，故对抗疱疹病毒药物进行分子筛选已成当务之急。UL12基因是疱疹病毒科基因组中的共同保守序列，其编码产物碱性核酸酶AN是疱疹病毒复制的关键酶，能分解病毒核酸复制中间体，促进病毒复制的生物合成和包装。因此，AN可以作为抗疱疹病毒药物的潜在新药靶，凡能使AN失活的中草药提取物则可能具有抗疱疹病毒活性。本项目在HSV-1 UL12基因克隆、表达的前期工作基础上，进一步大量表达有活性的重组AN，优化酶学反应条件。在阵列排布的药物筛选管中，用DNA-甲基绿显色技术高通量筛选AN的抑制剂，再用HSV、VZV、CMV三种疱疹病毒感染的细胞模型验证其抗疱疹病毒作用，并从计算生物学的角度分析阳性药物抑制AN作用的分子机制。本项目研究目标是建立高通量、低成本的抗疱疹病毒中草药提取物的AN分子筛选模型，对寻找抗疱疹病毒药物具有重要意义。

本研究项目的结果主要包括两方面内容：（1）进行抗HSV-1中草药提取物的AN高通量分子筛选方法的探索：成功表达纯化出具有酶活性的AN，并利用此酶建立高通量药物筛选反应体系。但由于荧光淬灭及本底高等技术原因，没能实现高通量筛选；（2）但建立了根据细胞病变判断的较低通量的筛选方法：即用反证法在病毒感染细胞模型上筛选出具有明显抗疱疹病毒（HSV-1、HCMV）活性的中草药成分，再验证其是否抑制疱疹病毒AN分子的活性。利用此方法，筛选出了具有明显抗庖疹病毒作用的中草药提取物为盐酸小檗碱、金丝桃素、甘草酸、黄芩苷和喜树碱。（3）实验证实了筛选出的金丝桃素和黄芩苷为AN抑制剂，并进一步研究了其抗庖疹病毒作用的作用机制，相关的工作包括：①盐酸小檗碱体外抗单纯疱疹病毒1型的作用及机制研究；②金丝桃素抗单纯疱疹病毒1型的作用及机制研究，证实金丝桃素为AN的抑制剂；③甘草酸体外抗人巨细胞病毒作用的研究；④在HSV-1感染的Vero细胞模型上筛选出黄芩苷具有抗HSV-1作用，实验证实黄芩苷为AN的抑制剂；⑤体外实验证实喜树碱通过抑制HSV-1复制相关基因的表达发挥抗HSV-1的作用。此外还进行了一些相关的抗微生物感染方面的探索。