TLR4通路调控阿片激动剂预处理抗炎与肝保护

Hepatic Ischemia and reperfusion (IR) is the most common pathologic procedure during hepatobiliary surgery and liver transplantation, and there is no proper solution until up to now. Toll like receptor 4 pathway plays a key role in activating inflammatory reaction after ischemia reperfusion (IR), and interfering strategy on TLR4 pathway might alleviate IR injury and appears confer therapeutic benefit. Based on our previous works,we supposed that opioid agonist remifentanil preconditioning would relieve the post-ischemic inflammmaory reaction through suppressing TLR4 expression. The present project will demonstrate the mechanism of TLR4 receptor on opioid hepatic protection by siRNA and adenovirus techniques in a rat liver IR model and primary hepatocyte cultures, and then the role of subsequent MyD88 and TRIF pathways and their key molecules will be explored via gene knockout animal models. Furthermore, selected cirrhotic patients with hepatic cancer undergoing hepatectomy will be enrolled for receiving opioid administration or epidural block as control, the postoperative hepatic function and activation of TLR4 will be compared in order to confirm the benefit of opioid preconditioning. Our project attempts to clarify the key mechanisms and targets of TLR4 in mediating opioid hepatic protection, and thus will be helpful for seeking out a clinical practical new therapeutic strategy in alleviating hepatic IR injury perioperatively.

肝脏缺血再灌注(IR)损伤是肝脏外科与肝移植最常见的病理过程，目前尚无妥善解决的方案。TLR4通路是激活肝IR损伤后炎性反应的核心环节，针对TLR4通路的干预对减轻肝IR损伤有一定的疗效。结合前期研究我们认为阿片激动剂瑞芬太尼预处理可抑制TLR4通路活性从而减轻IR损伤后炎症反应。本课题在前期工作基础上，拟采用鼠肝IR损伤模型和原代培养技术，通过TLR4目的基因转导和RNA干扰等手段，探讨TLR4通路在阿片激动剂肝保护效应中的地位；进而采用基因敲除动物明确TLR4下游两条重要信号通路（MyD88和TRIF通路）中的关键分子调控阿片激动剂的抗炎和肝保护的作用。最终通过选择肝脏手术病例，随机接受阿片预处理或硬膜外镇痛干预，探讨阿片对术后肝功能转归和IR损伤后TLR4通路激活的影响。本课题有望找到TLR4通路中参与阿片预处理抗炎作用的关键环节，摸索出具有临床实用价值的减轻肝IR损伤的治疗新策略。

研究背景：肝脏缺血再灌注（IR）损伤是一种常见的临床病理生理过程，临床上如何减少肝脏损伤，保护肝功能，防止肝功能衰竭是长期以来一直未妥善解决的一个难题。TLR4通路是激活IR损伤后炎性反应的核心环节，我们之前的研究初步证实阿片激动剂瑞芬太尼预处理减轻肝脏缺血再灌注损伤，本项目拟探讨阿片抗炎的具体机制及其与TLR4炎症通路关键分子的相互作用，期待找到阿片肝保护的关键环节点。.研究内容：。我们主要完成了以下内容：首先，通过肝脏IR小鼠模型、细胞缺氧复氧为离体模型，探讨mu阿片受体在肝脏缺血再灌注损伤中的作用；进一步采用TLR4基因敲除老鼠从整体动物水平探讨阿片受体激活的肝保护作用，并采用HMGB1中和抗体和siRNA干扰技术，对mu阿片受体的激活在抑制TLR4介导的肝脏IR损伤中的作用；最后，验证阿片激动剂能否通过抑制TLR4通路下游的关键分子的活性发挥肝保护作用，明确TLR4通路关键分子在阿片肝保护中的作用。.研究结果： 我们证实了阿片受体激动剂预处理对肝缺血再灌注损伤的保护作用：激活mu阿片受体可有效减轻野生小鼠的肝脏缺血再灌注损伤，降低血清转氨酶，降低肝脏组织中炎性细胞因子TNF-α、IL-6 mRNA水平；其作用机制可能依赖于MOR阿片受体。进一步通过野生型、TLR4-/-小鼠在体及离体的细胞实验，初步证实阿片受体可抑制TLR4通路，减轻肝IR损伤后的炎症反应，其次，阿片通过CamkⅣ减少HMGB1的释放，起到交叉抑制炎症反应的作用。而干扰CamkⅣ与阿片受体的激活在肝IR损伤的保护作用中具有重叠效应。我们还发现阿片激动剂可抑制TLR4通路下游的关键分子TRAF6和IFN-β mRNA，可导致TLR4/p-IκB/p-NF-κB蛋白表达下降，影响了TLR4下游NF-κB和IκB的磷酸化。阿片受体与TLR4之间可能存在的某些相互作用，研究没有发现阿片受体和TLR4在膜上有比较明显的共定位。.本项目科学意义：本课题采用转基因技术、RNA干扰技术和基因敲除动物模型，从整体动物、细胞和分子等多个水平观察TLR4通路在阿片激动剂减轻肝脏IR损伤中作用，证实阿片激动剂可通过抑制TLR4通路及其下游关键分子的活性来发挥抗炎和肝脏保护作用。初步明确了TLR4通路中关键的作用点和调控分子。研究结果将有助于找到切实可行的减轻肝IR损伤，为临床提高术后生存率的提供实验依据。