人泡沫逆转录病毒转导必需顺式（cis）序列的确定及功能分析研究

构建安全有效的基因载体一直是基因治疗应用的瓶颈问题。人泡沫病毒(HFV)是一种无致病性的特殊逆转录病毒，在其基础上构建的载体具有安全性高、可实现外源基因长期稳定表达等优点。国外研究者和申请人前期构建的HFV载体在转基因研究中取得了一定成果，但是目前的HFV载体存在包含大量野生型病毒序列的突出缺点，影响载体的安全性和转基因容量。为了有效地解决这个限制载体应用的问题，本项目拟根据生物信息学分析结果指导基因缺失和定点突变，运用限制性酶切，连接和PCR重组等方法构建系列载体，检测这些载体的转录效率，包装效率和转导外源报告基因的表达效率，确定HFV转导的必需顺式（cis）序列，分析和探讨相关顺式序列功能以及与病毒结构蛋白相互作用的分子机制。一方面进一步阐明泡沫病毒这一类非常规逆转录病毒独特复杂的复制机制，另一方面为构建安全、大容量、高效的HFV载体提供理论依据和实践指导。

构建安全有效的基因载体一直是基因治疗应用的瓶颈问题。人泡沫病毒(HFV)是一种无致病性的特殊逆转录病毒，在其基础上构建的载体具有安全性高、可实现外源基因长期稳定表达等优点。国外研究者和申请人前期构建的HFV载体在转基因研究中取得了一定成果，但是目前的HFV载体存在包含大量野生型病毒序列的突出的缺点，影响载体的安全性和转基因容量。为了有效地解决这个限制载体应用的问题，本项目在Genbank中获得了来自于非洲绿猴（NC_010802）、大猩猩（HM245790）等多条泡沫病毒序列，与人泡沫病毒（目前修订为原型泡沫病毒PFV，U21247）的序列进行多序列比对分析，确定了5′拼接供体（SD）、逆转录引物结合位点（PBS）等保守序列。运用限制性酶切，连接和PCR重组等方法构建系列PFV质粒载体，包括V-gp（含有PFV的gag和大部分pol序列）等。PFV质粒与辅助质粒共转染，收集病毒颗粒感染HT1080细胞，检测不同病毒载体的转导效率。在质粒转染后、以及收获包装的病毒载体后，提取总RNA并逆转录，real-time PCR检测病毒基因组含量，确定对病毒RNA转录和包装有影响的必须cis序列。最后，检测所收集的包装的病毒载体的逆转录酶活性，确定对病毒Pol蛋白包装有影响的必须cis序列。根据实验结果，获得PFV病毒基因组必须cis序列。本实验一方面进一步阐明了泡沫病毒这一类非常规逆转录病毒独特复杂的复制机制，丰富了对PFV的认知；另一方面为构建安全、大容量、高效的PFV载体提供了理论依据和实践指导。