DNA甲基化介导的CLDN6表达沉默机制及其对人乳腺癌细胞转移表型的影响

CLDNs是紧密连接的主要成分，其表达下调在乳腺癌等上皮来源的肿瘤转移中起关键作用。我们克隆鉴定了乳腺癌抑制基因CLDN6，发现其在乳腺癌中表达下调，特别是发现DNA甲基化是导致CLDN6在乳腺癌中失活的重要因素。鉴于CLDN6转录起始区有CpG岛，我们推测CLDN6在乳腺癌中表达下调是通过DNA甲基化介导的机制实现的。因此，本项目拟①用ChIP等技术，分析甲基化DNA与MeCP2的相互作用，阐明MeCP2在甲基化调控CLDN6转录中的作用；②用ChIP-reChIP等技术分析MeCP2与组蛋白修饰酶的作用网络，探讨组蛋白修饰对CLDN6表达的调控机制；③用核酸酶可及性实验分析染色质构象改变与CLDN6表达的关系；④沉默关键蛋白后检测CLDN6的转录活性及乳腺癌细胞的转移表型。最终首次揭示DNA甲基化导致CLDN6表达下调的分子机制及其在乳腺癌转移中的作用，为乳腺癌的诊治提供新的靶点。

我们前期工作中克隆和鉴定了候选乳腺癌抑制基因CLDN6，发现乳腺癌细胞和组织中CLDN6无或低表达，同时发现CLDN6表达下调与其DNA甲基化有关。本项目旨在利用Western Bot、染色质免疫沉淀技术、核酸酶可及性实验和RNAi等技术，探讨DNA甲基化导致乳腺癌细胞CLDN6表达下调的作用机制。本研究中，BSP法检测结果显示，MCF-7细胞CLDN6基因启动子区13个CpG位点中有11个发生甲基化，甲基化水平达到85%，并且5-aza-dC和TSA单独及联合作用MCF-7细胞上调CLDN6表达，证实MCF-7细胞中CLDN6表达下调与DNA甲基化有关；5-aza-dC和TSA单独及联合作用后，明显增加MCF-7细胞的TJ数量和跨上皮电阻，降低透过细胞层的FITC-右旋糖酐的量，说明CLDN6基因去甲基化能够增强TJ的结构和功能；ChIP和核酸酶可及性实验结果证实，DNA甲基化下调CLDN6表达DNMT1和CLDN6基因结合及染色质构象改变有关。采用SMADs抑制剂SB431542处理进一步研究发现，SMAD3表达水平参与介导DNMT1与CLDN6结合，影响CLDN6甲基化水平，进而影响细胞转移表型。本研究从分子水平上阐明甲基化DNA通过与特定的甲基化结合蛋白结合及染色质构象的改变引起乳腺癌细胞中CLDN6基因的转录失活，从而揭示乳腺癌发生和转移机制，不仅为有效地控制乳腺癌的转移及治疗提供实验依据，而且为抗肿瘤药物开发提供新的靶点。