基于PI3K/Akt/mTOR通路介导的自噬探讨葛根素抗亚慢性乙醇脑损伤的保护作用及机制

Ethanol is a recognized neurotoxic substance. Our data indicate that four days of binge drinking led to massive neuron degeneration in prefrontal cortex, accompanied by increased levels of PI3K/Akt/mTOR mediated autophagy pathway proteins. Puerarin can affect the expression of mTOR mediated autophagy pathway proteins and reduce the number of ethanol induced neuronal death. These results suggest that puerarin may regulate mTOR mediated autophagy against ethanol-induced neurotoxicity. The hypothesis will be confirmed by the following studies: 1.The role of autophagy pathway based on PI3K/Akt/mTOR in sub-chronic ethanol brain injury is determined by the study of autophagy activity.2.Through morphological observation of neurons, determination of apoptosis, oxidative stress and autophagy activity, determine the protection of Puerarin against sub chronic ethanol-induced brain injury, cascading effect and regulation of autophagy protein mTOR related reaction order from the overall level. 3.Through the regulation of mTOR signaling pathway, study the protective effect of Puerarin on ethanol induced neuronal damage, and to clarify the mechanism of Puerarin on the regulation of autophagy related protein mTOR and its mechanism. The aim of this study is to provide a new idea for the prevention and treatment of alcoholism and to provide a strong basis for the further study of the neuroprotective mechanism of puerarin.

乙醇是公认的神经毒性物质。我们的数据表明：短期大量给予乙醇导致大鼠大脑皮层神经元轴突损伤、神经元数量减少，伴随mTOR介导的自噬途径蛋白显著升高。葛根素可影响PI3K/Akt/mTOR介导的自噬途径蛋白的表达，并减少乙醇诱导的神经元死亡数量，提示葛根素可能通过调控mTOR介导的自噬发挥抗乙醇神经毒性损伤的作用。拟从下述研究证实该假设：1.通过自噬活性的研究，从功能上确定基于mTOR的自噬途径在亚慢性乙醇脑损伤中的角色。2.通过神经元形态学观察，凋亡小体、氧化应激及自噬活性测定，从整体水平确定葛根素抗亚慢性乙醇脑损伤的保护作用及调控mTOR相关自噬蛋白的网络、级联反应顺序。3.通过调控mTOR信号途径研究葛根素抗乙醇致神经元损伤的保护作用，从机理上明确葛根素调控mTOR自噬相关蛋白网络及其机制。旨在为临床研究防治乙醇中毒性疾病提供新思路，为进一步明确葛根素的神经保护机制提供有力依据。

本研究从整体-细胞水平探讨葛根素对抗乙醇神经毒性损伤的神经保护作用，通过干预mTOR通路考察mTOR介导的自噬途径在葛根素抗乙醇神经毒性损伤过程中发挥的角色，评估葛根素改善乙醇滥用导致神经退行性病变患者预后的临床价值。（1）利用连续大量灌胃给予乙醇4天法成功建立亚慢性乙醇脑损伤模型，给予葛根素干预后，发现葛根素可显著改善亚慢性乙醇脑损伤大鼠的空间学习记忆能力，减少亚慢性乙醇脑损伤大鼠前额叶皮层的坏死神经元数量，降低亚慢性乙醇脑损伤大鼠前额叶皮层氧化应激及凋亡水平。（2）亚慢性乙醇脑损伤大鼠I型PI3K/ Akt/ mTOR转导通路表达显著下降，自噬标志性蛋白LC3I/II显著升高，自噬生成关键因子显著升高，提示，亚慢性乙醇脑损伤大鼠脑内自噬活性显著被激活。给予葛根素干预的亚慢性乙醇脑损伤大鼠脑内PI3K/ Akt/ mTOR转导通路被激活，自噬关键蛋白显著低于模型组，说明葛根素可通过上调I型PI3K/Akt/mTOR转导下调亚慢性乙醇脑损伤大鼠脑内的自噬活性，发挥神经保护作用。（3）为明确葛根素是否通过调节大鼠皮层神经元的自噬水平发挥抗乙醇神经毒性损伤的作用，采用原代培养的大鼠皮层神经元，发现葛根素可一定程度的增加乙醇诱导的神经元细胞存活率，减轻乙醇诱导的神经元轴突受损程度，能有效减轻乙醇诱导的神经元氧化应激及凋亡，并可通过上调I型PI3K/ Akt/ mTOR转导下调乙醇诱导的神经元自噬活性一定程度的减轻乙醇诱导的神经元自噬水平。（4）利用自噬激动剂（雷帕霉素）及自噬抑制剂（3-甲基腺嘌呤）调控自噬，结果发现，适度自噬被诱导，可以一定程度的降低乙醇诱导神经元细胞损伤，抑制自噬后给予乙醇干预，神经元损伤情况加重。调控自噬，再次观察葛根素对乙醇诱导的神经元的保护作用，发现抑制自噬后，葛根素的神经保护作用受到一定的限制；适度诱导自噬，葛根素抗乙醇诱导的凋亡作用进一步下降，提示葛根素可能通过抑制乙醇诱导的过度自噬发挥神经保护作用。综上所述，葛根素可通过抑制mTOR通路介导的自噬途径发挥对抗乙醇神经毒性损伤的神经保护作用。