DLX3基因突变对牙釉质发育的影响及机理研究

In humans, mutations of DLX3 gene are associated with the pathogenesis of Tricho-dento-osseous (TDO) syndrome . The most distinct dental manifestation of TDO include enamel hypoplasia and taurodontism . Our current works showed that DLX3 is an active transcriptional regulator of enamelin in amelogenesis. However, it is not clear that the effects of mutation DLX3 on enamel development . Our aims of this study is to clarify this question by animal models and a series of in vitro assays. Firstly, we will generate a Dlx3 mutant zebrafish model by TALEN technique. By scanning electron microscope and microhardness testing we will observe the tooth structure and mineralization of mutant zebrafish. Secondly, we will construct a expression vector for mutant Dlx3 and introduced it into ameloblast cell lines. PCR and luciferase assays will be carried out to study the expression levels of enamel matrix proteins and promoter activities.This study will enhance our understandings of functional roles of DLX3 in the pathogenesis of amelogenesis imperfecta.

毛发-牙齿-骨骼综合征（TDO）在口腔中表现为釉质发育不全和牛牙症，有研究表明DLX3基因突变与TDO相关。本课题组在牙釉质发育的研究中发现DLX3在釉质形成过程中可能参与釉蛋白基因的转录激活，由此推测，突变DLX3可能是导致釉质发育不全的直接原因。本研究旨在通过动物模型和体外分子生物学实验，观察DLX3突变是否可以导致釉质发育不全，以及在这一过程中，突变DLX3对釉基质蛋白表达的影响。研究内容包括采用TALEN基因打靶技术构建Dlx3靶向突变的斑马鱼系，通过显微硬度测定和扫描电镜等方法观察Dlx3突变鱼牙釉质表型的变化。构建突变DLX3表达载体，采用体外真核细胞转染技术将突变的Dlx3转染至成釉细胞中，采用PCR和荧光素酶报告分析等方法检测釉质发育相关基因的表达和启动子活性。研究结果将为进一步揭示人类釉质发育不全的致病机理提供分子生物学的依据。

人类DLX3基因突变与常染色体显性遗传病毛发-牙齿-骨骼综合征（Tricho-Dento-Osseous syndrome，TDO，OMIM #190320）相关。TDO临床表现为釉质发育不全，牛牙症，毛发卷曲，颅骨的骨厚度和骨密度增加，颅骨板障闭合，额窦和乳突腔隙变小。本项目的研究目标是利用斑马鱼突变动物模型，观察DLX3在牙齿，骨骼发育中的重要作用，为DLX3基因突变人导致人TDO综合征的致病机理提供分子生物学依据。研究内容主要包括采用体外实验研究突变DLX3基因（c.571_574delGGGG）对釉质发育相关基因的影响。采用类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）基因打靶技术构建Dlx3b靶向突变的斑马鱼系，观察并检测Dlx3突变鱼牙齿骨骼的发育异常表型和Dlx3下游靶基因。研究结果：(1)突变Dlx3蛋白（TDO相关4G突变）能够在LS8细胞中抑制野生型Dlx3蛋白的转录激活作用，从而造成相关下游基因的异常表达和功能发挥。(2) 采用TALEN技术成功构建了Dlx3b靶向突变斑马鱼，对dlx3b突变斑马鱼的扫描电镜观察突变鱼咽齿尖端（类釉质）表面结构异常（V2），茜素红染色发现突变鱼脊柱弯曲、骨骼发育异常。能谱分析及红外光谱测定dlx3b突变鱼咽齿表面矿化元素（Ca/P含量降低）釉质矿物含量下降。采用Real-time PCR对Dlx3下游靶基因型进行分析发现下游基因Odam，Scpp1，Scpp9明显下调。总结：本项目通过成功构建Dlx3靶向突变斑马鱼成功模拟了人类TDO中釉质发育不全和骨骼发育异常。通过对突变鱼牙齿和骨骼的表型和对下游基因的分析，得出了一些有意义的结果，为DLX3导致釉质发育不全和骨骼发育异常的分子生物学机制提供了直接的证据。截至目前，有关结果已经整理成SCI论文3篇，其中正式发表2篇，有1篇正在撰写当中，即将投稿。