基于PI3K/Akt/mTOR通路介导的T细胞自噬探讨中药治疗免疫性血小板减少症的作用机制

Immune thrombocytopenia (ITP) is an autoimmune hemorrhagic disease, and T cell immune imbalance is the main pathogenesis. Cell autophagy is an important internal protection mechanism, but abnormal  autophagy could induce many diseases, including autoimmune disease, and the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway plays an important role in cell autophagy. Whether the pathogenesis of ITP is related to abnormal T cell autophagy? Whether the mechanism of traditional Chinese medicine in the treatment of ITP is related to regulate T cell autophagy mediated by PI3K/Akt/mTOR pathway? It is not clear. In the topic, ITP mice model was established, clinical chinese medicine was used to treatment, T cells in peripheral blood, thymus and spleen were sorted and purified using flow cytometry technology. The electron microscope will be used to observe the double membrane structure packaging the contents of a cell in the process of T cell autophagy (autophagysome), to explicit the change of T cell autophagy function in the cell ultrastructure level; using the cell immunofluorescence, to intuitively detect the location and expression of LC3B(microtubule associated protein 1 light chain3) in T cells; using the RT-PCR and Western blotting technology, to analyze the mRNA and protein expression level of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway, T cell autophagy specificity index LC3Ⅱ/LC3Ⅰ, the related index Beclin1 and degradation protein P62; aims to clear the correlation between pathogenesis of ITP and T cell autophagy, the molecular mechanism of T cell autophagy pathway using the clinical traditional Chinese medicine to treatment ITP, and to provide academic support for looking for new treatment means and methods, and to guide the development of safe and effective new clinical treatment drug.

免疫性血小板减少症（ITP）是一种自身免疫性疾病，T细胞免疫失衡是主要发病机制。自噬是细胞重要内在保护机制，但异常可引起多种疾病，包括自身免疫性疾病，而PI3K/Akt/mTOR通路在细胞自噬中起关键作用。ITP发病机制是否与T细胞自噬异常有关？临床中药治疗ITP作用机制是否与调节T细胞自噬路径有关？目前尚不清楚。本课题拟建立ITP小鼠模型，临床中药干预治疗，流式细胞术分选纯化T细胞，电镜观察自噬体结构，明确T细胞自噬功能的改变；免疫荧光检测T细胞LC3B的定位及表达；RT-PCR和Western blotting技术分析PI3K/Akt/mTOR通路、自噬特异性指标LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及相关指标Beclin1、P62的mRNA和蛋白表达水平；旨在明确ITP发病机制与T细胞自噬相关性、临床中药治疗改善ITP的分子机制，为寻找新治疗手段和方法，指导开发安全、有效的新型临床治疗药物提供学术支撑。

免疫性血小板减少症（ITP）是由于自身免疫异常导致的血小板破坏过多的临床综合征，以出血及外周血小板减少、骨髓巨核细胞正常或增多为主要临床表现的出血性疾病，部分患者可出现颅内出血以及消化道出血等危重情况进而影响患者生命。本科室根据中医辨证施治理论，针对ITP患者采用临床中药进行治疗，取得了较好的临床疗效，但具体作用机制尚不明确。研究表明，T淋巴细胞免疫失衡是ITP主要发病机制，深入研究ITP免疫失耐受机制将有助于发现干预免疫失耐受新的治疗手段和方法。自噬在细胞免疫失耐受中发挥重要作用，自噬通路调节的紊乱很可能是导致ITP的重要分子机制。本研究主要进行了ITP发病机制与T细胞自噬功能异常的相关性、T细胞自噬路径的分子机制、以及临床中药治疗改善ITP的分子机制与PI3K/Akt/mTOR信号通路介导的T细胞自噬相关性。我们的研究结果显示，采用GPS-APS方法建立的ITP小鼠模型符合人类ITP的临床特点，临床中药方对模型动物具有明显的整体改善作用；而且临床中药对ITP模型小鼠Th1/Th2和Th17/Treg免疫平衡具有明显的调节作用。ITP模型小鼠外周血和脾脏组织T细胞P62 mRNA和蛋白表达水平显著降低，LC3II/I、Beclin-1 mRNA和蛋白表达水平显著增加，而PI3K、AKT、mTOR的mRNA表达水平均显著降低；提示ITP模型T细胞自噬水平显著增强，这与PI3K/AKT/mTOR信号通路受到抑制有关，而加入自噬诱导剂雷帕霉素进一步提高T细胞自噬活性，加入自噬抑制剂3-MA显著降低自噬活性。临床中药方显著提高ITP模型小鼠外周血和脾脏组织T细胞P62 mRNA和蛋白表达水平，降低LC3II/I、Beclin-1 mRNA及蛋白表达水平，显著提高PI3K、AKT、mTOR的mRNA和蛋白表达水平；提示临床中药方能通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制T细胞自噬，从而发挥治疗作用。通过本研究，为揭示ITP发病机制与T细胞自噬相关性、临床中药治疗改善ITP的分子机制，提供学术依据和支撑。