家蚕脂肪酶Ⅰ基因的调控机制及与抗BmNPV的关联

Bmlipase-1 is a kind of proteinase in the digestive juice of silkworm, which plays an important role in resist to BmNPV infection, but the mechanism of regulation of Bmlipase-1 is not clear. In this proposal, both resistant variety of NILoLVR and susceptible variety of 306 will be used as research materials and infected by BmNPV, and then the differential transcription factors in regulating the promoter of Bmlipase-1 will be determined by using gel retardation electrophoresis technology. After that, differentially expressed genes in midgut will be obtained by using gene chips technology, and the binding proteins, which interact with Bmlipase-1 protein in differential gene library, will be screened by using yeast two-hybrid system. Furthermore, the function of transcription factors and binding proteins, which obtained by the above approaches, will be identified by the experiments. Based on the above experiment results, the expression mechanism of Bmlipase-1 in the silkworm will be elucidated, and its relation with resistance of BmNPV will be proposed. These results will be helpful for breeding the silkworm variety with high resistance against BmNPV in the future.

家蚕脂肪酶-1基因是目前家蚕消化液中明确鉴定的BmNPV抗性蛋白，在家蚕抗病毒过程中起着重要的作用。但该基因自身的表达调控机理尚不清楚。本课题以家蚕抗性品种NILoLVR、易感品种306为研究材料，在感染BmNPV的条件下，利用凝胶阻断电泳技术，确定调控Bmlipase-1基因启动子的转录因子；经基因芯片分析，获得中肠差异表达基因；运用酵母双杂交系统，筛选差异基因文库中与Bmlipase-1蛋白相互作用的结合蛋白质；对获得的转录因子、结合蛋白进行功能验证。提出家蚕脂肪酶Ⅰ基因的表达调控的分子机制，初步提出该机制与抗BmNPV的关联，为进一步提高家蚕抗BmNPV的能力提供新的理论依据。

家蚕在大量进食期间，脂肪酶Ⅰ基因可以提高蚕体自身的BmNPV抵抗力。家蚕抗BmNPV 分为两个阶段：首先是阻止病毒侵染家蚕细胞，可能与家蚕中肠细胞受体蛋白的特性有关；其次是病毒侵入中肠细胞并扩散进体腔之前，家蚕启动细胞凋亡程序、消化液抗病毒蛋白发挥灭活作用，阻止病毒复制、扩增。家蚕脂肪酶-1是消化液中明确鉴定的BmNPV 抗性蛋白。家蚕品种对核型多角体病的抗性存在差异。感染BmNPV 后，抗性品种（NIL•LVR）平均表达量是易感品种（306）的12.4 倍。.1. 对NIL•LVR、306蚕品种的Bmlipase-1基因cDNA进行克隆、分析。与p50序列相比，编码区、3’非编码区序列一致。说明Bmlipase-1抗性与基因结构无关。.2.对p50家蚕品种的Bmlipase-1启动子调控序列进行克隆，并对各个启动子元件的活性进行分析，获得核心启动子区域（已发表）。研究结果不仅有助于揭示Bmlipase-1表达的调控机制，而且对阐明家蚕抗BmNPV的分子机制也具有一定的参考价值，获得的启动子片段也可用于研究家蚕中肠表达基因。.3. 抗BmNPV蚕品种 NIL•LVR的Bmlipase-1基因启动子区克隆及活性分析。从NIL•LVR中肠组织中克隆到1012 bp大小的启动子片段，并对该片段进行启动子活性分析。根据荧光信号及Western Blot方法可知BGPH＞BGNILLVR＞LipF2R2。说明Bmlipase-1基因抗性与基因表达量呈正相关。.4. 感染BmNPV的家蚕中肠组织蛋白的非标记定量蛋白质组学分析。将BmNPV感染抗性品种NIL·LVR，感染后48 h对其中肠进行非标记定量蛋白质组学分析。结果是有48个蛋白质表达量上调，其中感染BmNPV的Bmlipase-1的表达量是对照的6倍；24个蛋白质表达量下调；有5个蛋白质只是在感染BmNPV的家蚕中表达；另外有5个蛋白质只是在非感染BmNPV的家蚕中表达。该结果为研究家蚕中肠蛋白质抗BmNPV的机理提供依据。.5. Bmlipase-1抗BmNPV机制初探 经多步克隆，将BmNPV的多角体基因、NILLVR启动子、BmLipase-1（eGFP）克隆到pFastBac-1中；重组病毒感染BmN细胞后进行 realtime-PCR。结果是BmLipase-1抑制dbp基因表达，从而影响病毒的复制增值。