村山醌生物合成及其骨架重排机制的研究

Bacterial aromatic polyketides, derived from type II polyketide biosynthetic pathway, are a family of natural products with diverse structures and important pharmacological uses. Murayaquinone, found in several streptomycetes, possesses an unusual tricyclic angular aromatic polyketide core containing a 9,10-phenanthraquinone. Early feeding experiments using isotope-labeled precursors indicated that murayaquinone is biosynthesized via oxidative carbon skeleton rearrangement, which exists in several other type II polyketide biosynthesis and is important for their biological activities. However, the detailed mechanism inside this rearrangement is still unknown. We identified the murayaquinone biosynthetic gene cluster from Streptomyces griseoruber Sgr29 and the genes essential for murayaquinone biosynthesis were also identified through gene inactivation. Three oxidoreductases, MrqO3, MrqO6, and MrqO7 were determined to be involved in the special oxidative carbon skeleton rearrangements. In this project, a combination of genetic and enzymatic studies will be used to elucidate murayaquinone biosynthetic pathway. In particular, the mechanism of the skeleton rearrangement involved in murayaquinone biosynthesis will be elucidated and this knowledge will lay a framework for engineering oxidations in type II polyketides.

细菌来源的芳香聚酮化合物由II型聚酮合酶催化合成，常具有多样的骨架结构和良好的生物活性。II型聚酮化合物村山醌具有一个独特的三个芳香环呈角形排列的核心结构，同位素喂养实验显示，其角环骨架经历了复杂的氧化开环和换位闭环的过程，类似的过程在部分角形II型聚酮的生物合成中也普遍存在，但其重排机制尚未阐明。前期，我们首次从一株链霉菌中克隆了村山醌的生物合成基因簇，利用基因敲除确定了与其生物合成相关的基因，并发现了三个与重排相关的蛋白。本项目中，我们将针对村山醌特殊的角环重排过程，通过体外生化、蛋白晶体结构解析等手段揭示这种新颖的角环芳香聚酮骨架的形成机制，为进一步利用氧化重排改造II型聚酮结构提供参考。在此基础上，对村山醌的生物合成进行系统研究，阐明其完整的生物合成途径，为进一步挖掘该类天然产物的生物活性奠定基础。

芳香型聚酮（II型聚酮）化合物是一大类结构多样且具有重要生物活性的天然产物，是许多重要药物的源泉。村山醌是由链霉菌产生的一种9,10-菲醌结构的芳香型聚酮化合物，蕴藏着新颖的生物合成机制。本研究前期利用活性导向的高通量筛选技术成功克隆了村山醌的生物合成基因簇（mrq），并发现在其生物合成中包含一个由MrqO7、MrqO6和MrqO3共同催化的碳骨架重排过程，然而mrq基因簇中其他一些蛋白的功能依然悬而未决。本课题中，我们主要针对村山醌生物合成中的一些特殊的酶学催化过程和一些功能未知却对村山醌生物合成非常重要的酶以及II型聚酮天然产物的生物合成中一些共性问题进行一系列系统的研究并取得了一些阶段性成果。首先，我们发现了以MrqM为代表的一类短链脱氢/还原酶（SDR）家族蛋白在村山醌和其它一些II型聚酮生物合成中的重要功能，揭示了MrqM参与村山醌C5-C14间第二环的形成，这是首次报道SDR家族蛋白参与芳香型聚酮化合物环化的案例。其次，基于生物信息分析、遗传学和体外生化实验，揭示了MrqO1在村山醌生物合成中的碳碳双键还原的功能，并获得了两个带有支链双键的村山醌衍生物。第三，通过体外生化和活性位点定点突变，初步研究了MrqO6催化聚酮骨架重排的机制。第四，通过序列分析及遗传学实验初步研究了磷酸化酶MrqG在村山醌生物合成中的独特功能。第五，我们通过基因组合串联的方式，利用最少的基因组合异源重构了村山醌前期生物合成过程，并利用此体系验证和推测了相关基因的功能，为进一步的功能研究打下基础。最后，建立了以大肠杆菌为宿主的芳香聚酮化合物的生产平台，并通过优化和引入特异性的硫酯酶，大幅提高了芳香聚酮在大肠杆菌中的产量。对村山醌生物合成过程的探究不仅有利于丰富现有的芳香聚酮生物合成酶学机制，而且可以为将来应用合成生物学和代谢工程等手段进行产量提高和结构改造以产生具有重要临床药用价值的化合物提供有力支持。