苹果转录因子MdTGA2.1的抗病功能及对PR基因的调控作用

TGA transcription factors enhance disease resistance through positively regulating PR gene expression in plants. In the preliminary study, MdTGA2.1, a TGA transcription factor in apple, has been isolated by yeast two-hybrid screening,and over-expression and antisense vectors have been constructed. In addition, the MdTGA2.1-GFP transgenic apple plantlets have been obtained. On this basis, we plan to stablely introduce vectors into apple and arabidopsis mutant，and then verify the function of MdTGA2.1 through disease resistance identification of transgenic apple plants and the functional complementation experiments of arabidopsis mutant. To identify candidate PR genes regulated directly by MdTGA2.1, we will search in whole-genome of MdTGA2.1-GFP transgenic apple with chromatin immunoprecipitation sequencing(ChIP-Seq). Then ChIP-PCR, electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and real-time quantitative RT-PCR will be performed to verify regulation MdTGA2.1 to PR genes and response of PR genes to infection.Through the implementation of this project, the function of MdTGA2.1 in disease resistance will be characterized, Furthermore, the PR genes obtained in this study，as marker genes for defense activation， will play important roles in identifying the resistance function and mechanism of other resistant genes，and providing theoretical basis for apple disease resistance breeding.

TGA转录因子通过上调PR基因的表达增强植物的抗病性。项目组通过酵母双杂交筛选从苹果中分离了1个TGA转录因子MdTGA2.1，并构建了MdTGA2.1的过量和反义表达载体，而且已获得了转MdTGA2.1-GFP基因的苹果组培苗。在此基础上，本项目拟转化苹果和拟南芥突变体，通过转基因苹果的抗病性鉴定以及拟南芥突变体的功能互补试验，鉴定MdTGA2.1的抗病功能；利用转MdTGA2.1-GFP的苹果材料，通过ChIP-Seq技术在全基因组范围内寻找MdTGA2.1调控的PR基因，并利用ChIP-PCR、EMSA和qRT-PCR等技术证明MdTGA2.1对PR的调控作用及PR基因对病菌侵染的响应。通过本项目的实施，不仅能阐明MdTGA2.1的抗病功能，而且获得的PR基因可以作为防御激活的标记基因，为苹果中其他抗病基因的功能鉴定及抗病机理研究奠定基础，并为苹果抗病育种提供理论依据。

项目背景：中国苹果栽培面积和产量均位居世界首位，但各种苹果病害每年都给苹果产业造成巨额损失，已成为制约我国苹果产业、健康发展的瓶颈。模式植物的研究表明：水杨酸（SA）是植物重要的抗病信号分子之一。TGA转录因子是SA信号转导途径关键的转录调节因子，其能够直接与非表达病程相关蛋白基因（NPR）相互作用并激活下游病程相关蛋白基因（PR）表达，从而增强植株抗病。但多年生木本植物苹果中尚缺乏相关研究报道。为了挖掘苹果中抗病相关TGA转录因子并获得其调控的靶标基因，解析苹果中TGA转录因子的抗性机制，我们开展了本项目的研究。.主要研究内容：①转化拟南芥tga2/5/6三突变体进行功能互补；②MdTGA2.1的抗病功能鉴定；③MdTGA2.1调控的下游抗性相关靶基因的获得及其与靶基因启动子间的相互作用验证。.重要结果：①利用酵母双杂交和pull-down技术对MdTGA2.1与MdNPR1之间的相互作用进行了鉴定；②转化拟南芥tga2/5/6三突变进行功能验证，证明MdTGA2.1具有拟南芥TGA类似的抗性功能,可明显降低三突变体对SA及JA的敏感性，并提高转基因植株的抗病性；③对过量表达MdTGA2.1的苹果愈伤组织中候选的靶基因进行表达分析，成功筛选到靶标基因；同时，利用蛋白质组技术也筛选到了候选PR类基因；对候选靶基因的启动子进行了克隆，并进一步利用ChIP-PCR技术对MdTGA2.1与靶基因之间的相互作用进行了验证。.科学意义：通过本项目的研究，成功对多年生木本植物苹果MdTGA2.1基因的功能进行了鉴定，并将MdNPR1、MdTGA2.1和MdYPR10/MdGSTU1等多个抗性相关基因整合到了一个信号转导单元，对于未来解析多年生木本植物广谱抗性的分子机制和通过基因工程手段进行广谱抗性苹果新种质的培育均具有重要意义。