苹果bZIP转录因子基因MdFD通过选择性剪接调控开花的分子机制研究

The long juvenile phase severely restricts the genetic studies and breeding efficiency of perennial woody fruit trees. Previous studies have shown that the mechanism of FT/FD complexes regulating plant flowering and FD directly interacting with target gene promoters are conserved among different species, but the regulation mechanism is not clear. In previous study, the project team found that MdFD underwent alternative splicing (AS), resulting in two splice variants (MdFD-α and MdFD-β). Notably, transgenic plants overexpressing MdFD-α accelerted flowering, while transgenic plants overproducing. MdFD-β exhibit delayed flowering. On this basis, this project firstly intends to identify the effects of environmental factors and tree age on the expression of two mRNAs by qPCR and semi-quantitative RT-PCR; Secondly, the interactions among MdFD-α, MdFD-β and MdFT1 will be determined using pull-down, Y2H, and BiFC; Thirdly, the target genes will be identified using the method of RNA-Seq and ChIP-Seq; and then, the effect of MdFD-β on the regulation of the MdFT1/MdFD-α complex will be analyzed by electrophoretic mobility shift assay and transient expression assay. Collectively, these findings will reveal a novel AS mode of MdFD regulating flowering in apple, which would lay a foundation for the ultimate realization of flowering time control of woody plants.

漫长的童期严重制约了多年生木本果树的遗传学研究和育种效率。以往研究表明，植物FT/FD复合体促进成花的作用在不同物种间具有较强的保守性，FD负责直接与靶基因启动子相互作用，但其调节机制尚不清楚。项目组在前期对苹果FD基因的研究中发现，该基因存在MdFD-α与MdFD-β两种mRNA，转基因验证表明，两者对开花分别具有促进与抑制作用。在此基础上，本项目拟通过qPCR与半定量RT-PCR探究环境因素与树龄对两种mRNA表达的影响；利用pull-down、Y2H及BiFC技术对MdFD-α、MdFD-β与MdFT1两两间的互作关系进行鉴定；通过转录组与ChIP-Seq相结合分离靶基因，然后采用电泳迁移率实验与瞬时表达技术解析MdFD-β对MdFT1/MdFD-α复合体调控能力的影响。综合上述多方面的证据，揭示苹果MdFD通过选择性剪调控开花的分子机制，为最终实现木本植物开花时间调控奠定基础。

植物可通过改变前体信使RNA（pre-mRNA）剪接位点而由同一基因生产出多种mRNA转录本，利用这种方式对自身的生长发育及环境适应性进行精致的调控。漫长的童期严重制约了多年生木本果树的遗传学研究和育种效率。以往研究表明，植物FT/FD复合体促进成花的作用在不同物种间具有一定的保守性，FD负责直接与靶基因启动子相互作用，但其调节机制尚不清楚。我们在研究中发现MdFD存在全长型的MdFD-α以及缺少C端功能域的MdFD-β两种转录本。因此，为了建立苹果中FT/FD调控开花时间的信号转导途径，我们鉴定了MdFD-α、MdFD-β以及MdFD同源基因MdFD-like调控开花时间的功能、蛋白之间的相互作用关系以及MdFD调控的下游基因。结果显示：过表达MdFD-α与MdFD-like的转基因拟南芥较野生型植株开花时间大幅提前，而过表达MdFD-β的转基因拟南芥植株则表现为开花延迟，说明MdFD-α/MdFD-like与MdFD-β在调控植株开花时间上具有相反的作用。萤火素酶互补、双分子荧光互补以及酵母双杂交等研究结果显示，MdFD-α/MdFD-α、MdFD-α/MdFD-like蛋白间存在强烈的相互作用，MdFD-α/MdFD-β、MdFD-α/MdFT1、MdFD-like/MdFD-β、MdFD-like/MdFT1、MdFD-like/AtFD以及MdFD-like/AtFT之间均能发生相互作用；但MdFD-β则因缺少C端功能域而丧失了与MdFT1的互作能力。我们进一步通过DIP-seq以及转基因材料的转录组分析，对MdFD结合的顺式作用元件及其调控的信号途径进行了探究。此项目的实施，揭示了苹果中MdFD通过选择性剪接调控植株开花的分子机制，拓展了人们对于苹果开花时间调控的认识，为通过基因工程手段培育早花苹果提供了理论基础。