中国人群角蛋白8基因多态性与原发性胆汁性肝硬化的关系及机制研究

原发性胆汁性肝硬化（Primary Biliary Cirrhosis, PBC）是一种自身免疫性肝病。抗线粒体抗体为PBC的特征性血清学标志，其最主要的靶抗原是酮酸脱氢酶复合体E2。广泛表达于有核细胞的线粒体蛋白如何突破免疫耐受，引起小胆管上皮特异性免疫损伤是亟待研究的问题。我们的前期研究发现角蛋白8((keratin，KRT/K))基因多态性在汉族PBC患者中比例增高。结合K8-/-小鼠血清抗线粒体抗体阳性，我们假设K8突变可能破坏小胆管细胞线粒体完整性和致使蛋白转运异常、线粒体抗原易位，导致死亡细胞清除异常并引起小胆管局部免疫应答。因此，本项目拟通过分子流行病学研究KRT8基因多态性与中国汉族PBC的关系。通过激光共聚焦、Western blot等方法研究角蛋白的构象、磷酸化；线粒体的结构、功能和抗原分布；通过体外免疫应答实验，从线粒体抗原角度探讨影响PBC免疫调控的分子遗传机制。

原发性胆汁性肝硬化（Primary Biliary Cirrhosis, PBC）是一种自身免疫性肝病。前期研究发现角蛋白8(keratin8，KRT8)基因多态性在汉族PBC患者中比例增高。结合KRT 8-/-小鼠血清抗线粒体抗体阳性，我们假设KRT 8突变可能破坏小胆管细胞线粒体完整性和致使蛋白转运异常、线粒体抗原易位，导致死亡细胞清除异常并引起小胆管局部免疫应答。本项目通过病例对照研究，通过调查问卷的形式对2010-2015年西京消化病医院接诊的512名PBC患者进行调查，数据通过SPSS19.0软件进行分析，设立761名否认肝脏疾病参加健康体检人群为对照组。结果观察到心理应激、户外暴露时间、染发以及异常妊娠可能是PBC发病相关危险因素。根据目前已经报道的与PBC以及与自身免疫性疾病和肝脏疾病相关的基因多态性单核苷酸（SNPs）。针对参与免疫调节、胆汁排泄、胆管上皮损伤机制的19个基因中的49个SNPs设计引物并合成芯片；筛选后应用显性模型、隐性模型以及共显性遗传统计模型分析，发现定位于KRT8基因的位点(P<0.001)。其中rs8608与熊去氧胆酸应答相关。进一步构建过表达以及干扰KRT8慢病毒载体，感染人肝胆管癌细胞。采用免疫细胞化学细胞实验发现，过表达以及干扰KRT8的RBE细胞同对照组相比，角蛋白的正常的结构破坏，且分布发生变化，细胞核出现明显的固缩，细胞凋亡率明显上升，GCDC作用促进KRT8表达异常细胞的凋亡。过表达以及干扰KRT8的RBE细胞同对照组相比线粒体的正常结构破坏，且分布发生变化。流式细胞仪分析显示过表达以及干扰KRT8的人肝胆管细胞的活性氧含量明显上升，GCDC作用促进KRT8异常表达人肝胆管细胞线粒体丝状断裂以及活性氧的生成。Western Blot检测了AKT信号转导通路研究显示，过表达或干扰KRT8 RBE细胞AKT的磷酸化蛋白水平明显下调，而总蛋白水平无明显变化； AKT下游的细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Cleaved caspase-3也出现了相应的变化，进一步证实KRT8表达异常可能通过AKT信号通路调控细胞的凋亡。研究结果提示KRT8异常可能与PBC发病相关；KRT8表达异常可能通过AKT信号通路异常激活使细胞易受胆汁酸盐诱导的凋亡和线粒体损伤相关。