银翘散及其拆方对流感病毒感染自然杀伤细胞免疫监视作用影响的分子机制研究

The previous studies have shown that Yinqiaosan recipes improve the natural killer (NK) cell function in spleen of influenza virus-infected mice, regulate the serum concentrations of antiviral cytokines related with cytotoxicity of NK cells, and reduce the p65 mRNA expression in lung. p65 is a critical inflammatory cytokine when NF-κB signaling pathway is activated. This project intends to further study the molecular mechanisms of immune surveillance role on influenza virus-infected natural killer cells medicated with Yinqiaosan recipes. Yinqiaosan recipes will be used in the study and will be decomposed according to the principles of formulating prescription in traditional Chinese medicine combined with natural pharmaceutical chemistry theory and factorial analysis method. Treatment of Yinqiaosan recipes and its decomposed recipes on influenza virus-infected mice will be explored; respectively. Simultaneously, the activated receptors on pulmonary NK cells will be detected in pneumonia mice. Influenza virus-infected NK cells will be used as a model in the study. Antibody-dependent NK cell-mediated cytotoxicity, innate cytolytic effects, apoptosis effects induced by TNF-α and effect on viral replication will be examined in the treatment of Yinqiaosan recipes and its decomposed recipes; respectively. Comparison will be conducted in the medication between Yinqiaosan recipe and its decomposed recipes, and the pharmacodynamic material will be elucidated in this study.

前期研究显示银翘散能够提高流感病毒感染小鼠脾脏自然杀伤细胞（NK）活性；调节NK细胞相关抗病毒细胞因子的血清含量；降低肺脏炎症因子p65mRNA的表达（p65是NF-κB信号通路活化的关键蛋白）。本课题拟进一步从流感病毒的免疫逃逸与NK细胞的免疫监视的理论视角，探讨银翘散对流感病毒感染NK细胞免疫学功能的影响。课题以银翘散作为研究对象，通过传统中医药"君、臣、佐、使"的拆方研究模式，结合中药化学理论研究模式和数字设计模式的研究方法，考察银翘散及其拆方对流感病毒感染小鼠肺炎模型的治疗作用及对肺脏NK细胞表面活化抗原表达的影响；并进一步建立流感病毒感染NK细胞模型，采用分子生物学方法，检测流感病毒感染过程中，NK细胞介导的抗体依赖的细胞毒作用、天然细胞毒作用以及细胞凋亡作用中的关键分子，并检测NK细胞中流感病毒载量，阐明银翘散对流感病毒感染NK细胞免疫监视作用调节的药效物质基础。

本课题从银翘散全方中通过抗流感病毒实验和自然杀伤细胞激活性受体的检测，筛选到臣药（牛蒡子、薄荷、荆芥穗、淡豆豉）可以单独作为一个整体用于流感病毒感染小鼠肺炎模型的治疗；在治疗病毒性肺炎时，能够提高肺脏自然杀伤细胞活性。重要的是，臣药在治疗肺炎和提高自然杀伤细胞活性方面，均显著优于银翘散全方。在药物构成的数量和药效方面，臣药均体现出良好的特点。.在臣药有效的基础上，我们在其药效物质中，筛选到（牛蒡苷+大豆素+甘草酸+甘草苷）作为一个化合物复方，能够治疗流感病毒感染小鼠肺炎模型，药效与阳性抗病毒药物利巴韦林相当；能够显著提高肺脏自然杀伤细胞活性，效果与阳性药物自然杀伤细胞激活剂雷利度胺相当；而且，化合物复方对流感病毒感染小鼠的体重有明显的促进作用，优于利巴韦林。.银翘散、臣药和复方化合物能够提高因流感病毒感染引起的自然杀伤细胞内部氢离子浓度降低的现象；同时降低PLC-γ1 Tyr771的磷酸化水平，促进自然杀伤细胞的ADCC作用。银翘散和臣药能够提高TNF-a的含量，复方化合物不能提高TNF-a的含量。在体外细胞研究中，复方化合物能够同时降低流感病毒核蛋白的基因表达和蛋白表达；银翘散和臣药仅在蛋白层面降低核蛋白的表达。银翘散、臣药和复方化合物能够通过Caspase途径和NF-κB途径降低流感病毒引起的凋亡。银翘散、臣药和复方化合物的转录组学分析显示，药物能够对细胞生长、物质和能量代谢方面的相关基因进行调节，增强自然杀伤细胞自身的细胞活性，如锌指蛋白编码基因ZFP36L1和ZFP36L2，他们编码的蛋白参与细胞生长发育过程。流感病毒感染后，自然杀伤细胞中ZFP36L1和ZFP36L2的基因表达下调，银翘散、臣药和复方化合物均显著上调它们的表达水平。说明药物对自然杀伤细胞自身的活性具有促进作用，进而确保自然杀伤细胞能够发挥抗病毒能力。