益气化瘀清热方及其拆方对肾MsC、足细胞作用的分子机制研究

From the thought of speculating the syndrome-pattern with the prescription, the experiential prescription, with the function of replenishing Qi, removing blood stasis and clearing heat, is taken apart into the replenishing Qi group(Huang-qi, Dang-shen), the removing blood stasis group(Dan-shen, Shui-zhi), and the clearing heat group(Huang-qin, Pu-gong-ying). With the animal experimental study, the effect of all the Chinese medicine and its compound prescription on the kidney pathology and the biochemical parameters will be compared. With serum-pharmacology methods, the effect of all the Chinese medicine and its compound prescription on the renal MsC and the podocyte in vitro. Based on the expression of the transient receptor potential cationchannel6 (TRPC6) and the cytoskeletal nephrin and podoein and the representitive indicators: the signal protein system of TGF-β―TGF-β receptor―Smad, the signal transduction pathway of MAPK, the ubiquitin proteasome pathway, the signal pathway of NF-κB／IκB, the following issues will be approached: the functional mechanisms of the traditional Chinese medicine; the choiced premium medicine; the comparison among all the medcine; definitude the importance of the blood stasis and the heat toxin in the glomerulonephritis onset; put forward a new point integrated with the basic TCM theory: the glomerulonephritis is rooted in the heat and the blood stasis.

从以方测证的思路出发，把经验方益气化瘀清热方拆分为益气组（黄芪、党参）、化瘀组（丹参、水蛭）、清热组（黄芩、蒲公英）。应用动物实验的研究方法，比较各类药物及其复方对肾脏病理、生化指标的影响强度；采用血清药理学的方法分析各类药物及其复方对体外培养的肾系膜细胞、足细胞的作用强度，以足细胞瞬时受体电位阳离子通道蛋白6及骨架蛋白nephrin、podoein表达和系统的具有代表性的分子生物学指标（TGF-β―TGF-β受体―Smad信号蛋白系统；MAPK信号转导通路；泛素－蛋白酶体途径；NF-κB／IκB信号通路）为依据，探讨中药的作用机制；筛选理想药物；比较各类药物的作用效果；明确血瘀、热毒在肾小球肾炎发病中的重要地位，结合中医基本理论研究，建立肾小球肾炎瘀热为本的新理论。

传统认为中医水肿（肾小球肾炎）以虚为本，但临床化瘀、清热药物很常用，是否瘀热占更重要地位，传统标本理论是否已不适应肾脏病临床实际，值得探讨。本课题按以方测证的思路研究中医标本，把有效方益气化瘀清热方按治法拆为益气、化瘀、清热三类，用其代表药物作为干预措施，证明肾小球肾炎瘀热为本（更重要）的假说。并明确中药作用机制。.成功制作足细胞、系膜细胞（MsC）损伤模型，在此基础上，证实益气化瘀清热方及其拆方对培养的足细胞TRPC6、podocin、podocalyxin mRNA及蛋白表达有肯定影响。化瘀组、清热组、复方组表达TRPC6mRNA明显优于益气组；但在蛋白表达上益气、清热、复方组优于化瘀组。作用48h足细胞podocin mRNA表达益气组弱于其他组，但对蛋白表达化瘀组优于益气和清热组。作用24h podocalyxin mRNA表达清热组优于其他各组,其他各组无效；作用48h后，各含药血清均可升高其表达，复方组最强，化瘀组优于益气和清热组；对其蛋白表达作用24h无效，作用48h，复方组、化瘀组升高明显，其他各组无效。.证实益气化瘀清热方及其拆方对MsC产生炎性介质的重要影响因素TGF-β―TGF-β受体―Smad/ p-MAPK信号通路、NF-κB／IκB-UPP信号通路有肯定作用，不同类中药的作用强度不同。通过对TGF-β1、TGF-βRI mRNA、Smad2 mRNA、Smad3和p38MAPKmRNA及其蛋白的检测，显示中药各组均有作用，且化瘀、清热组优于益气组。对IκB-αmRNA及其蛋白、泛素mRNA表达的影响清热组、化瘀优于益气组；NF-κBp65 mRNA及其蛋白表达化瘀组强于益气、清热组。 .MsC 增殖、凋亡、凋亡调控基因Bax和Bcl-2蛋白表达、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ各项指标均显示复方组、清热组、化瘀组优于益气组。. 对IgA肾病模型血尿、蛋白尿的作用清热组、化瘀组优于益气组；肾脏病理各组差异不明显；但对nephrin、podocin、pS6蛋白表达则显示化瘀组和清热组作用优于益气组；p-4EBP1表达三组差别不明显。.上述系统研究结果说明益气化瘀清热方及其拆方对系膜细胞、足细胞、肾病模型多个环节有作用，大多数指标显示清热组、化瘀组作用优于益气组，说明肾小球肾炎的病机关键在于热和瘀，临床应重视化瘀和清热药物的应用。