基于代谢组学技术的邻苯二甲酸二异辛酯的大鼠生殖毒性的研究

邻苯二甲酸二异辛酯[di(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP]是一种应用广泛的邻苯二甲酸酯类增塑剂，具有明显的生殖毒性。目前对DEHP的生殖毒性的研究主要是利用免疫学、基因组学和蛋白组学等方法，但毒理效应可能与基因的改变和蛋白质的合成无关，利用代谢组学技术研究DEHP的生殖毒性能获得更多更直接的信息，可作为其他方法的补充和佐证，目前国内外还鲜有这方面的研究报道，且DEHP的生殖毒性机制还不是很清楚。本项目拟通过代谢组学技术研究DEHP对大鼠的生殖毒性，用不同剂量的DEHP对大鼠睾丸支持细胞和卵巢颗粒细胞分别染毒，再对两种生殖细胞进行代谢组学分析，获得"代谢产物谱"，与对照组对比分析，探寻DEHP生殖毒性的特征代谢物，发掘潜在的生物标志物，探讨可能的作用机制，为DEHP的生殖毒性的预防及治疗提供实验依据和可能的指标参数，同时也为研究环境污染物的生物毒性提供新的思路和途经。

邻苯二甲酸二异辛酯[di(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP]是一种应用广泛的邻苯二甲酸酯类增塑剂，具有明显的生殖毒性。目前对 DEHP 生殖毒性的研究主要是利用免疫学、基因组学和蛋白组学等方法，但毒理效应可能与基因的改变和蛋白质的合成无关，利用代谢组学技术研究 DEHP 的生殖毒性能获得更多更直接的信息，可作为其他方法的补充和佐证。本实验利用GC-TOF/MS技术建立了SD大鼠生殖细胞的代谢组学方法，实验结果表明，利用0.9%的NaCl溶液在4℃下对该种细胞具有最佳的淬灭效果，淬灭后立即用1 mL 50% 乙腈的水溶液在0℃下能有效提取浓度为浓度为5×106细胞中的代谢产物。该方法可检测到44种代谢产物，15种氨基酸在浓度范围在2.35–150.20 μg/mL时具有良好的线性关系（R＞0.99）、检出限和定量限，而且方法的重现性良好（日内和日间精密度的RSD＜20%），样本和仪器的稳定性也适合该种细胞的代谢组学分析。实验中对培养的SD大鼠生殖细胞进行不同毒性和不同时间的侵染，利用GC-TOF/MS和多种数据分析方法对侵染程度不同的生殖细胞中代谢产物进行检测分析，结果表明，受侵染的细胞具有明显的剂量依赖性和时间依赖性。多元数据分析表明，所建立的细胞侵染模型具有良好的稳定性和预测能力（R2Y(cum)＞0.9，Q2(cum)＞0.7），利用PCA和 PLS-DA分析获得了22种差异代谢产物，这些代谢产物涉及到与生殖细胞调控相关的多种代谢通路，包括氨基酸的代谢与合成（如丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、缬氨酸、亮氨酸等）、谷胱甘肽合成代谢途径、脂肪酸代谢、磷脂代谢、丙酮酸代谢等，这些途径都与细胞内三羧酸循环途径造成影响，这些途径都会影响到细胞对外源性毒物侵染的应激反应，最终造成生殖细胞的非可逆性损伤。本课题为探寻塑化剂生殖毒性的作用机制提供了可靠的方法学和实验模型，也为 DEHP 的生殖毒性的预防及治疗提供了实验依据，同时也为研究环境污染物的生物毒性提供新的思路和途经。