基于SiRNA抑制疟原虫入侵红细胞的研究

疟疾是一种严重危害人类健康的寄生虫性传染病，全球每年死亡人数多达100多万。疟原虫是疟疾的病原体，其中恶性疟原虫危害最严重，疟原虫裂殖子入侵红细胞是引起临床症状的关键步骤和先决条件。本研究拟应用SiRNA抑制恶性疟原虫裂殖子入侵红细胞的两个关键分子，即裂殖子表面蛋白1（MSP1）和顶端膜抗原1(AMA1)的表达，分别从分子水平、光学显微镜和电子显微镜水平来分析抑制这两个分子后对疟原虫的影响。期望通过阻断疟原虫裂殖子入侵红细胞，抑制裂殖子增殖。为控制当前开始出现广泛抗药性的疟原虫提供一种新的治疗思路和策略。本研究亦将为疟疾后基因组时代，研究新基因功能打下重要的理论和实践基础。

本项目原计划以恶性疟原虫入侵红细胞过程中的关键分子AMA1和MSP1为靶点，设计合成同时干扰这两个分子表达的siRNA，探讨能否通过siRNA干扰降低疟原虫的感染率。第一年度的研究结果显示原设计的siRNA转染体外培养的恶性疟原虫后，未能观察到其对疟原虫感染率的抑制作用，也未检测到该siRNA对AMA1和MSP1分子表达的下调作用。分析原因可能由于以AMA1和MSP1为共同靶点设计siRNA的可供选择范围较窄，造成靶点选择不当。同时，候选的siRNA分子应该首先通过可靠的生物学实验确定其对靶蛋白的干扰效果。由于疟原虫是否存在经典的RNA干扰机制仍存在争议，其在进化过程中是否存在类似RNA干扰的代偿机制也并清楚。因此，有必要尝试以siRNA表达载体替代体外合成siRNA分子，以充分利用疟原虫可能存在的RNA干扰代偿机制或旁路途径。基于以上结果分析，我们重新设计若干针对疟原虫AMA1分子的siRNA表达载体，首先以293T细胞为模型筛选出对AMA1过表达有确切干扰效果的三个siRNA表达载体，然后将这三种siRNA表达载体通过电穿孔方式转染体外同步化培养的疟原虫.通过realtime-PCR和Western Blot实验验证siRNA对AMA1表达的干扰效果，结果显示siRNA表达载体AMA1i-148对恶性疟原虫AMA1具有明显的干扰作用，AMA1的mRNA和蛋白水平均有下降，该结果为疟原虫可能存在RNA干扰机制或者是其代偿机制提供了新的佐证。相关研究结果我们已经投递至Molecular Biology Reports杂志，目前正在审稿中。