尘螨ppLase协同诱导哮喘发病的免疫学机理研究

Our previous results demonstrated that , dust mite ppLase has no immunogenesity, but it could induce Th2- or Th17- type immunological response. Therefore, we wonder whether dust mite ppLase play a role in the pathogenesis of asthma and the underlying mechanism. In combination with recent reports, we hypothesized that dust mite ppLase may potentiate Th0 cell to differentiate into Th2 cell by activating DC directly or indireactly, via upregulation of intracellular immuno-modulator IRF4, which is called ‘ppLase synergestic effect hypothesis’. We plan (1) to study the synergestic effect of ppLase in dust mite allergens induced asthma animal model; (2) to explore the detailed mechanisms by which ppLase activates DC and potentiate Th2 polarization, using isolated DC or epithelial cell model. This project will confirm the ‘ppLase synergestic effect hypothesis’ in the pathogenesis of allergic asthma, and discuss the internal connection between asthma occurrence and lung microinviroment, which will provide new therapeutic target for asthma.

我们前期研究结果显示，尘螨ppLase无免疫反应性，但具有诱导Th2或Th17型免疫反应的功能。那么，尘螨ppLase在哮喘发病中的作用及其相关机制是什么？结合文献报道，我们假设尘螨ppLase可能直接或间接作用于树突状细胞（DC），上调其表面协同刺激分子或内部免疫调节因子IRF4的表达，诱导Th0细胞向Th2细胞分化，并提出尘螨ppLase在哮喘致病中的“协同效应假说”。本课题将开展以下研究①建立哮喘动物模型,观察ppLase在粉尘螨主要过敏原诱导哮喘中的协同作用；②分离各组动物肺组织中的DC和上皮细胞，探讨粉尘螨ppLase是直接作用于DC还是通过改变上皮细胞/微环境从而活化DC，诱导Th2细胞极化；并进一步探讨DC细胞活化的具体机制。本项目将阐明尘螨ppLase在哮喘致病机制中的“协同效应假说”，并且探讨哮喘与肺组织免疫反应的内在联系和区域免疫学特性，为哮喘的防治提供新的理论依据。

在近几十年过敏反应学研究中，人们只重视尘螨过敏原（Der f1-33）的研究，而对尘螨众多的非过敏原蛋白从未予以关注。本研究在运用蛋白组学技术对粉尘螨进行研究基础上，首次选择粉尘螨酞脯氨酸异构酶（Pplase）进行分子生物学研究，并对其在过敏反应中的作用机制进行研究。..结果显示，克隆表达纯化后的粉尘螨Pplase蛋白经临床皮肤试验和sIgE检测证实不是尘螨过敏原组份（不具有过敏原性）。利用PBS、Pplase、OVA和Pplase/OVA分别免疫小鼠，建立过敏性哮喘模型，通过对气道高反应性（AHR）以及肺泡灌洗液、肺组织病理变化进行检测，我们发现单独Pplase组与对照组相比没有显著性差异，而Pplase/OVA组明显高于OVA组。结果表明，尘螨非过敏原蛋白Pplase增强了OVA诱导的气道过敏反应并进一步促进Th2细胞极化（具有协同效应）。..我们进一步观察Pplase如何作用于DC细胞促进Th0细胞向Th2细胞的分化偏移，将DC2.4作为研究对象，利用RT-PCR和流式细胞仪检测了CD80、CD40、IRF4、和TNF-α的表达水平，发现Pplase能够显著增强CD80、IRF4、和TNF-α的表达，但对于CD40的表达并无影响。利用western blot对IRF4蛋白进行检测，发现Pplase能够显著上调IRF4得表达。利用TLR4抑制剂和抗TLR2抗体阻断相应通路，发现在TLR4抑制剂存在的情况下，TNF-α的表达明显被抑制，而在抗TLR2抗体存在的情况下，其与对照组相比并无显著性差异。结果表明Pplase最主要通过TLR4调控DC的功能。此外，我们通过免疫细胞过继实验证明Pplase通过作用DC增强过敏反应。..本研究首次提出尘螨非过敏原蛋白（Pplase）在过敏性疾病发病中的“协同/叠加效应假说”，为过敏性疾病的发病机制和防治提供新的理论依据。